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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Preparación e intubación de ratones
- Anestesiar ratones jóvenes C57B1/J6 (20-25 g) por inhalación de sevoflurano al 8% con 0,5-1,0 L/min deO2 al 100% en un tubo cónico.
- Compruebe la profundidad de la anestesia con el reflejo de retirada del pellizco de los dedos de los pies.
- Coloque el ratón en decúbito dorsal sobre una placa inclinada y proceda a la intubación orotraqueal.
- Mueva el mouse a la almohadilla térmica y conecte rápidamente el tubo orotraqueal al ventilador para iniciar la ventilación mecánica.
- Ajuste los parámetros del ventilador a una frecuencia de 160 respiraciones/min y un volumen corriente de 10 mL/kg.
>2. Preparación para la cirugía (tanto para cirugías de bandas como de desbandado)
- Afeitar y aplicar la crema depilatoria desde el escote hasta la mitad del pecho de los ratones.
- Aplique gel oftálmico en los ojos de los animales para evitar que la córnea se reseque.
- Coloque una sonda rectal y el oxímetro en la pata o la cola para controlar la temperatura y la oxigenación de la sangre, y la frecuencia cardíaca, respectivamente.
NOTA: La anestesia induce una hipotermia significativa, por lo tanto, es importante mantener una temperatura corporal normal durante la cirugía para evitar una disminución rápida de la frecuencia cardíaca.
- Mantener la anestesia con sevoflurano (2,0–3,0%). Verifique el nivel correcto de anestesia por la ausencia del reflejo de pellizco del dedo del pie.
- Coloque los ratones en decúbito lateral derecho sobre una almohadilla térmica y asegure las extremidades al sistema de retracción del fijador magnético con una cinta para mantener al animal en la posición correcta durante la cirugía (Figura 1, Figura 2A).
- Desinfectar el pecho del ratón con alcohol al 70% seguido de una solución de povidona yodada.
>3. Cirugía de banda aórtica ascendente
- Con una cuchilla desechable, realice una pequeña incisión cutánea (~0,5 cm) en el lado izquierdo, inmediatamente debajo del nivel de la axila, y diseccione la piel.
- Diseccione y separe suavemente el músculo pectoral y otras capas musculares hasta que las costillas se vuelvan visibles. Use pinzas finas y evite cortar el músculo.
- Bajo un microscopio, identifique los espacios intercostales y abra una pequeña incisión entre el2º y el3º espacio intercostal con pinzas finas.
- Retraiga las costillas colocando el retractor de tórax (Figura 1A).
- Use pinzas pequeñas para diseccionar y separar suavemente los lóbulos tímicos hasta que la aorta ascendente se haga visible.
nota: Los aplicadores de algodón deben estar a mano en caso de sangrado. Se debe administrar solución salina estéril tibia por vía subcutánea en caso de sangrado significativo (p. ej., la arteria mamaria).
- Use pinzas pequeñas para diseccionar suavemente la aorta.
NOTA: Se considera que la aorta está disecada cuando no hay grasa u otras adherencias a su alrededor y es posible rodear fácilmente el vaso con una pinza de curva pequeña.
- Después de la disección aórtica, coloque una ligadura de polipropileno 7-0 alrededor de la aorta mediante el uso de una ayuda de ligadura y pinzas curvas (Figura 1B).
- Coloque la aguja roma de 26 g paralela a la aorta (la punta apuntando hacia la cabeza del ratón) (Figura 1B). Para ratones que pesan entre 20 y 25 g, esta aguja induce una constricción aórtica reproducible del 65 a 70%.
- Haga 2 nudos sueltos alrededor de la aorta y la aguja de 26 G con la ayuda de 2 pinzas (Figura 1B).
- Apriete el1º nudo y, poco después, el2º nudo. Confirme brevemente la posición correcta de la constricción y retire rápidamente la aguja para restaurar el flujo sanguíneo aórtico. Por último, hacer un3º nudo (grupo BA).
- Vuelva a colocar el timo y los músculos en su posición inicial.
- Realice el procedimiento simulado de manera idéntica al procedimiento de constricción, pero manteniendo la sutura suelta alrededor de la aorta (grupo SHAM).
- Corta los extremos de la sutura y retira el retractor torácico.
NOTA: Los extremos cortos de las suturas pueden aumentar la probabilidad de que los nudos se aflojen con la presión aórtica, mientras que los extremos largos hacen que el procedimiento de desbandado sea más riesgoso, ya que pueden producirse adherencias entre la sutura y la aurícula izquierda.
- Cierre la pared torácica con una sutura de polipropileno 6-0 con una sutura simple interrumpida o continua utilizando el menor número de puntos posible. Apriete el último nudo del pecho con los pulmones inflados al final de la inspiración pellizcando el flujo de salida del ventilador durante 2 segundos para volver a inflar los pulmones.
- Cierre la piel con una sutura de seda/polipropileno 6-0 en un patrón de sutura continuo.
NOTA: Si se utiliza un ventilador más reciente, es posible programarlo para que haga una pausa en la inspiración (Configuración-Avanzado-Pausa-Inspiración)
>4. Cuidados postoperatorios
- Aplique la solución de povidona yodada en el sitio de la sutura de la piel.
- Para una analgesia adecuada, administrar buprenorfina por vía subcutánea 0,1 mg/kg, dos veces al día, hasta que el animal se recupere por completo (generalmente 2-3 días después de la cirugía).
- Inyectar solución salina estéril por vía intraperitoneal para evitar la deshidratación en caso de sangrado importante durante la cirugía.
- Apague la anestesia (sin desintubar el ratón) y espere hasta que el animal recupere los reflejos (los movimientos de los bigotes son una señal de despertar) y comience a respirar espontáneamente.
- Retire la cánula traqueal.
- Deje que el animal se recupere en una incubadora a 37 °C.
- Regrese al animal a una sala de ciclo de luz/oscuridad de 12 horas después de la recuperación completa.
5. Cirugía de Debandación Aórtica
- Siete semanas después, se realiza el desbandado de la aorta en la mitad de los animales BA.
- Repita todos los pasos 1.1 a 2.6 mencionados anteriormente.
- Diseccionar suavemente los tejidos, las adherencias y la fibrosis alrededor de la aorta hasta que su constricción se haga visible.
- Diseccione cuidadosamente la aorta y separe la sutura de la aorta. Corte la sutura con unas tijeras de resorte de una sola sonda en ángulo (Figura 2B).
- Cierre la pared torácica con una sutura de polipropileno 6-0 con una sutura simple interrumpida o continua utilizando el mínimo número de puntos posibles.
NOTA: Trate de apretar la última sutura torácica cuando los pulmones estén inflados para evitar neumotórax.
- Cierre la piel con una sutura de seda/polipropileno 6-0 en un patrón de sutura continuo.
- Realice todos los procedimientos de cuidado postoperatorio como se menciona en el paso 4.
