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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE
1. Preparación de la solución de colorante azul de metileno
- Mida 0,1 g de polvo de azul de metileno.
- Disuelva el azul de metileno en 10 mL de solución salina normal o 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) completamente por vórtice.
- Filtre la solución de azul de metileno de 10 mg/ml con un filtro de jeringa (tamaño de poro de la membrana de 0,45 μm) para eliminar la obstrucción durante la inyección.
- Prepare un juego estéril de venas para el cuero cabelludo (27 G x 3/4") con una jeringa desechable de 3 mL y llene la jeringa con 3 mL de solución de azul >nota: Para evitar la presión hidrostática y el posterior flujo de tinte, coloque la punta de la aguja sobre la jeringa llena de solución de azul de metileno.
>2. Disección de embriones prenatales
- Tijeras y pinzas de disección limpias con etanol al 70%.
- Para recolectar embriones perinatales en E18.5 o E19.5, primero se practica la eutanasia a las ratas embarazadas mediante inhalación de CO2 y luego se realiza la luxación cervical de acuerdo con las pautas de los NIH.
nota: La rata hembra embarazada suele dar a luz a partir de E18.5, sin embargo, los riñones más grandes son más fáciles de manipular. Por lo tanto, los riñones con E19.5 más cerca del nacimiento son más fáciles de realizar este análisis. Sin embargo, los cachorros con obstrucciones bilaterales del tracto urinario mueren después del nacimiento. Dependiendo de las características de los ratones experimentales, se debe determinar empíricamente un día/hora de recolección apropiado.
- Rocíe etanol al 70% en la superficie abdominal ventral y luego abra la cavidad abdominal ventralmente con tijeras de disección y fórceas.
- Levanta todo el útero y sepáralo del cuerpo cortando con tijeras de disección las puntas de los cuernos uterinos.
- Enjuague todo el útero con 1x PBS en una placa de Petri.
- Cortar el útero segmentariamente con tijeras de disección y extraer la decidua placentaria con pinzas de disección para exponer los embriones en sacos vitelinos.
- Primero se retira el saco vitelino y luego se retira la membrana amniótica con pinzas de disección para liberar los embriones perinatales.
- Decapita un embrión con tijeras de disección. Limpie el exceso de sangre con gasas estériles. Sujete el embrión con su superficie ventral hacia arriba en un microscopio de disección equipado con una cámara digital para obtener imágenes. Recoge su cola para el genotipado si es necesario.
nota: Realice inyecciones de un embrión a la vez.
- Abra cuidadosamente la cavidad abdominal de un embrión con fórceps rasgando la piel. Luego, extraiga cuidadosamente el exceso de órganos y tejidos, como el hígado, el estómago y el intestino, con fórceps, cortándolos o tirando de ellos para exponer los riñones, los uréteres y la vejiga que se encuentran dorsalmente (Figura 1A). Absorber el exceso de sangre del embrión disecado con gasas estériles si es necesario.
nota: El exceso de sangre interfiere con la identificación de la pelvis renal para la inyección de tinte.
>3. Inyección de tinte azul de metileno en la pelvis renal y monitoreo del flujo de tinte
- Elimine las burbujas en la aguja y el tubo expulsando la solución de azul de metileno de la punta de la aguja mediante presión hidrostática. Levante la jeringa que contiene la solución de tinte por encima del nivel de la punta de la aguja para iniciar el flujo y luego baje la jeringa para detener el flujo.
- Inserte la aguja en la pelvis renal cerca del uréter proximal, teniendo cuidado de no alterarla una vez colocada. Realizar una inyección de tinte en un riñón para determinar su obstrucción del tracto urinario.
nota: Realice la inyección de tinte en cualquier riñón anormal, primero, siguiendo el mismo camino para determinar su obstrucción del tracto urinario.
- Levante la jeringa unos 20 cm para proporcionar presión hidrostática y deje que fluyan de 15 μl a 60 μl de la solución de colorante. El caudal será de unos 3 μL/s si la jeringa se eleva a esta altura por encima del embrión.
- Controle el color azul del tinte comenzando primero en la pelvis renal, luego en la longitud del uréter y finalmente en la luz de la vejiga.
nota: Se necesitan unos 5 segundos para ver emerger un color de tinte débil dentro de la luz de la vejiga si el uréter se inserta correctamente en la vejiga. Deje que el tinte se acumule en el sitio bloqueado aproximadamente 15 s si no aparece color de tinte en la luz de la vejiga.
- Coloque la jeringa hacia abajo para detener el flujo de tinte y retire la aguja del riñón.
- Tome imágenes del riñón, el uréter y la vejiga trazadas con una solución de tinte utilizando la cámara y el programa de imágenes conectado a un microscopio estereoscópico.
- Haga un registro de la hidronefrosis del riñón, el hidrouréter y la posición final de la solución de tinte en un cuaderno de laboratorio.
- Realice la inyección del riñón contralateral como se describe en los pasos 3.1 a 3.5 y permita el flujo de tinte unos 20 s en total.
nota: El lumen de la vejiga se llenará con una solución de tinte, indicada por un color azul fuerte, si el uréter se inserta correctamente en el lumen de la vejiga. Después de la evaluación de la obstrucción de la unión del tracto urinario, los uréteres y la vejiga se pueden fijar para la sección.
