Aislamiento de ovario de ratón neonatal: un procedimiento quirúrgico para extraer un par de ovarios a partir de un modelo de ratón neonatal

Resumen

Fuente: et al. Morgan, S. Cultivo y cocultivo de ovarios de ratón y folículos ováricos. J. Vis. Exp. (2015).

En este video, describimos un procedimiento quirúrgico para aislar ovarios de un ratón neonatal.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Disección y cultivo de ovario neonatal

1. Coloque 1 mL de medio de disección (disuelva 3 mg/mL de BSA en medio Leibowitz L15 y filtre la esterilización a través de un filtro de poro de 0,2 μm y 25 mm de diámetro) en cada placa de embrión de vidrio estéril.
2. Sacrificio de crías de ratón neonatales de entre el día 0 y 5 postnatal, sacrificadas por decapitación.
3. Agarre la piel que cubre la pared abdominal con un par de pinzas de disección finas y haga una incisión grande en la piel y la pared del cuerpo. Abra la incisión para que todo el abdomen quede expuesto. La vejiga suele estar congestionada en esta etapa y se puede perforar para facilitar la disección.
4. Aparta las tripas con unas pinzas de relojero. Siga los cuernos uterinos desde la vejiga hasta el riñón a cada lado. El ovario se encuentra justo debajo del riñón en la parte superior del útero y aparecerá como una estructura similar a una nube bajo un microscopio de disección.
5. Agarre el ovario suavemente con pinzas de relojero y use unas tijeras para cortar su unión al útero. Transfiera el par de ovarios a placas de embriones que contengan medio de disección precalentado.
6. Realizar la disección fina de los ovarios bajo un microscopio de disección en una platina calentada (37 °C). Use agujas de insulina para recortar el saco bursal y cualquier exceso de material, incluida la trompa de Falopio, hasta que solo quede el ovario.
7. Transfiera cada ovario al pocillo de una placa de cultivo con una pipeta de vidrio curvo finamente estirada.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Leibowitz L15	Invitrogen	11415049
αMEM	Invitrogen	22571020	Se suministra en forma de bicarbonato de sodio tamponado (2.200 mg/L)
Albúmina sérica bovina	Sigma Aldrich	A9418	Para medio de disección
Albúmina sérica bovina	Sigma Aldrich	A3311	Para el medio de cultivo
Albúmina sérica bovina	Sigma Aldrich	A2153	Para el recubrimiento de pipetas de vidrio
Fsh	Merck Serono	Gonal F	A menudo es necesario realizar pruebas por lotes. Prepare la solución madre de 1 UI/10 μL en αMEM y almacene a -20 °C
Filtros de jeringa (25 mm, 0,2 μm)	Greiner	16532K	Filtro de acetato de celulosa para filtrar volúmenes mayores (>5 mL) de medio.
Tubos estériles	Greiner	187261
Placa de 24 pocillos	Greiner	662160
Agujas de insulina	Suministros médicos BD	037-7606	0,33 mm (29 g) + 1 ml
Platos de embriones de vidrio	VWR	720-0579	Esterilizar, luego calentar antes de usar
Pipetas de vidrio	Fisher Científico	10209381	Recubrimiento BSA antes de su uso
Agujas de acupuntura	Acumedic LTD	30 mm x 0,25 Tipo C
Solución de formalina, tamponada neutra, 10%	Sigma Aldrich	HT5014-120mL
Membranas de nucleóforos de Whatman	Camlab	WN/110414	Superficie brillante, policarbonato, 13 mm de diámetro, tamaño de poro de 8,0 μm