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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Animales
- Mantener ratones hembra adultos de 3 a 6 semanas de edad en una habitación con temperatura y humedad controladas (con fases de 12L:12D y alimentados ad libitum).
- Inyecte a los ratones por vía intraperitoneal 2,5 UI de gonadotropina sérica de yegua embarazada (PMSG) para estimular el crecimiento folicular imitando los efectos de la hormona estimulante del folículo (FSH). Aislar los ovarios para la recolección de ovocitos antrales 48 h después. Sacrificar al ratón hembra previamente inyectado con PMSG, según las pautas estándar.
- Extraer rápidamente los ovarios de la cavidad corporal y colocarlos en la placa de Petri que contiene medio M2 para el posterior aislamiento de los ovocitos (ver sección 3).
- Realizar una incisión en la piel que cubre la pared abdominal seguida de una incisión en el peritoneo utilizando tijeras de disección estériles. Abra la incisión para exponer el abdomen, mueva las tripas de un lado con pinzas estériles y localice las trompas uterinas, formando una forma de V a partir de la vejiga.
- Observa los ovarios ubicados debajo de los riñones. Sostenga cada tubo con pinzas estériles y haga una pequeña incisión en la parte inferior de los ovarios para liberarlos. Transfiera ambos ovarios en la parte inferior de una placa de Petri que contenga medio preequilibrado.
>2. Preparación hormonal
- Diluir PMSG (disponible en diferentes concentraciones de stock) con solución salina isotónica estéril para obtener una concentración de trabajo de 2,5 U.I. de hormona por 0,1 mL para un volumen de inyección adecuado.
nota: Las soluciones hormonales deben alícuota en tubos de 0,5 ml y almacenarse a -20 °C hasta el día de su uso. No conservar las alícuotas diluidas durante más de tres meses a -20 °C. Una vez descongelados, si se realizan inyecciones en serie, almacenar las alícuotas de las soluciones hormonales a +4 °C y utilizarlas en un plazo de 4 días.
>3. Aislamiento de ovocitos antrales
Para un correcto aislamiento de los ovocitos:
- Equilibrar el medio M2 (M2) al 5% de CO2 y 37 °C durante al menos 1 h antes de iniciar el procedimiento de aislamiento de ovocitos. Prepare dos placas de Petri (35 mm x 10 mm), una con 1 mL de M2 para la punción del ovario y la segunda con pequeñas gotas (20 μL) de M2 cubiertas con aceite mineral (~1,5 mL) para la transferencia de ovocitos después del aislamiento del ovario (ver pasos 3.4-3.6). Mantenga ambas placas de Petri en la incubadora a 5% de CO2 y 37 °C hasta que estén listas para usar.
- Utilice un microscopio estereoscópico durante los procedimientos de aislamiento de ovocitos.
- Prepare pipetas de vidrio de boca fina para recoger los ovocitos estirando las pipetas Pasteur de vidrio mantenidas horizontalmente (sujetando los extremos de la pipeta con ambas manos), sobre una llama vertical procedente del mechero Bunsen (Figura 1).
- Una vez que el vidrio comience a derretirse, retire la pipeta de la llama y realice un rápido movimiento de tracción para obtener la pipeta deseada. Corte firmemente el exceso de vidrio cerca del punto estrecho de la pipeta con las uñas para ajustar la longitud y el diámetro del capilar interno. Asegúrese de que el capilar delgado tenga un diámetro interno de ~100 μm, ligeramente mayor que el diámetro del ovocito (~80 μm).
- Para la pipeta bucal, conecte un extremo del tubo aspirador a la pipeta extraída utilizando una punta adecuada y coloque el otro extremo en la boca, asegurándolo con los dientes.
- Recoger los ovarios con pinzas estériles y depositarlos en el fondo de una placa de Petri de cultivo celular (35 mm x 10 mm). Cúbralos con 1 mL de M2 previamente equilibrado a 37 °C y 5% de CO2 (Figura 2).
- Punción suave de los folículos antrales de los ovarios con una aguja de jeringa de insulina estéril para liberar los ovocitos antrales en M2 (Figura 3).
- Pipetear suavemente los ovocitos con la boca a través de una pipeta Pasteur estrecha para eliminar las células del folículo y cualquier otro posible residuo de tejido (Figura 4A) y luego depositarlos en el fondo de pequeñas gotas (20 μL) de M2 cubiertas con aceite mineral apto para el cultivo de embriones (previamente preparado; Figura 4B).
nota: Es importante eliminar todos los cúmulos de células adheridos a la zona pelúcida de los ovocitos mediante pipeteo continuo a través de varias y diferentes gotas de M2. Realiza este paso lo más rápido posible para evitar alteraciones en el pH del medio.
