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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado animal y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Inyecciones dobles de resina
- preparación
- Prepara la solución de resina. Para inyecciones de resina de doble sistema, prepare resinas amarillas y verdes como se describe en los pasos 1.1.2-1.1.4.
- Prepare 1 mL de alícuotas de resina diluida por ratón.
- Resina amarilla: Diluya el caucho de silicona amarillo (alta radiopacidad) con el diluyente claro en una dilución 3:1 para preparar la resina amarilla para la inyección.
- Resina verde: Mezcle caucho de silicona azul (radiopacidad indetectable) con el diluyente transparente en una dilución 1:1 para preparar resina azul. Para generar resina verde, mezcle la resina azul diluida con la resina amarilla diluida en una proporción de 1:1. Agite la resina verde a fondo hasta que el color sea homogéneo.
nota: La resina azul tiene una radiopacidad muy baja que no es detectable con microCT, por lo que es necesario diluirla con resina amarilla para crear dos resinas con radiopacidades diferentes
cautela: La resina puede contener cromato de plomo, que es un carcinógeno. Produce gases venenosos en caso de incendio. Manéjela con cuidado y deseche la resina como residuo peligroso.
- Prepare dos juegos de inyección (juego de inyección # 1 y equipo de inyección # 2) con tubo como se describe en los pasos 1.1.6-1.1.11.
nota: Para ratones adultos (>P30 (día postnatal 30) = P30 - 2 años), use el juego de inyección #1 (tubo de PE10 con un diámetro exterior de 0,6 mm) para la inyección en el conducto biliar común y el juego de inyección #2 (tubo de PE50 con un diámetro exterior de 0,96 mm) para la inyección en la vena porta. Para ratones posnatales jóvenes (hasta P30), prepare dos juegos de inyección # 1, uno para el conducto biliar y otro para la inyección de la vena porta (sin juego de inyección # 2 ya que la vena porta es demasiado estrecha para acomodar tubos de PE50).
- Para preparar el juego de inyección # 1, corte 30 cm de tubo de PE10 y estire un extremo del tubo con la mano tirando de él hasta que se vuelva lo más delgado posible (Figura 1A, B, aproximadamente 0,15 mm de diámetro, el tubo de PE10 no estirado tiene 0,6 mm de diámetro).
- Corte la punta del tubo de PE10 estirado en diagonal para crear una punta biselada (Figura 1B).
- Conecte el extremo no estirado del tubo de PE10 a una aguja de 30 G (Figura 1A, equipo de inyección #1).
- Para preparar el equipo de inyección # 2, corte 30 cm de tubo de PE50 y estire un extremo del tubo con la mano tirando de él hasta que se vuelva lo suficientemente delgado como para caber en la vena porta (Figura 1A, B, aproximadamente 0.7 mm, el tubo de PE50 no estirado tiene 0.96 mm de diámetro).
- Corte la punta del tubo PE50 estirado en diagonal para crear una punta biselada (Figura 1B).
- Conecte el extremo no estirado del tubo PE50 a una aguja de 23 G (Figura 1A, set de inyección #2).
nota: Cada juego de inyección solo se puede usar para una inyección, ya que la resina se endurecerá en la jeringa y el tubo. Ajuste el tamaño de la punta estirada y biselada en función del tamaño del conducto biliar común y la vena porta del ratón, en función de su edad, genotipo y fenotipo. Cuando no esté seguro sobre el tamaño y el ajuste del tubo, inserte el tubo en el conducto o recipiente apropiado después de la incisión y antes de que el tubo se llene con resina. Si el tubo es demasiado ancho para caber en el conducto/recipiente, estírelo más.
- Anestesiar al animal por inhalación de isoflurano (primero 4% en la cámara de inducción y ~2% usando el cono nasal).
- Coloque el ratón en un banco ventilado sobre una almohadilla de disección mientras el ratón está respirando isoflurano a través del cono de la nariz. Verifique que el animal esté inconsciente mediante un método recomendado por el instituto/IRB, por ejemplo, pellizcando una de las patas.
cautela: El isoflurano puede causar somnolencia o mareos al inhalar y puede causar daño al sistema cardiovascular y al sistema nervioso central a través de la exposición prolongada o repetida. No lo inhale. Manipule la sustancia en un banco ventilado y en áreas bien ventiladas.
nota: Es posible utilizar otro método anestésico, siempre que sea compatible con la perfusión cardíaca.
- Una vez que el animal esté inconsciente, rocíe el lado ventral con etanol al 70% para evitar la interferencia del pelaje.
- Con unas tijeras para la piel, corte la piel, la fascia y la capa muscular comenzando en la línea media de la cavidad abdominal y corte hasta la cavidad torácica para exponer los órganos internos.
- Agarre la apófisis xifoides con pinzas para levantar el esternón y corte el diafragma y la caja torácica en ambos lados para exponer el corazón y los pulmones.
- Retire la caja torácica cortando las costillas de los lados izquierdo y derecho de la caja torácica con unas tijeras. Tenga mucho cuidado de no dañar el hígado, ya que esto provocará una fuga de la resina.
- Con pinzas rectas, tire del corazón hacia el hígado y corte la aurícula derecha.
- Inserte una aguja de mariposa (23 G), conectada a una bomba de perfusión peristáltica, en el ventrículo izquierdo. Perfundir el ratón por vía transcárdica con solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) y heparina (1 U/g de peso corporal del ratón). Perfundir durante 3 min con una tasa de perfusión de 5 mL/min.
nota: Si el ratón se perfunde correctamente, los órganos internos se pondrán pálidos, especialmente el hígado. Si, en cambio, los pulmones se vuelven blancos, la aguja se inserta en el ventrículo derecho y se debe reposicionar. Después de la perfusión, el ratón se desangra y se puede extraer del cono de la nariz y del isoflurano.
- Apague la bomba de isoflurano.
2. Inyección de resina - Sistema biliar de fundición de resina
- Mueva el ratón hacia el microscopio de disección, el abdomen hacia arriba, la cola hacia el experimentador y la cabeza alejada del experimentador. Los puntos de referencia anatómicos de interés se representan en la Figura 2A.
- Localice la vena cava inferior (Figura 2A) moviendo el intestino hacia un lado. Utilice unas tijeras de resorte para realizar una pequeña incisión transversal en la vena cava inferior para permitir la liberación de la presión vascular hepática (Figura 2Bi).
- Exponga el conducto biliar común y la vena porta como se describe en los pasos 1.2.4 a 1.2.6.
- Mueva el intestino y el páncreas hacia el lado derecho (del experimentador) con un hisopo de algodón humedecido con solución salina tamponada con fosfato (PBS).
- Voltea el lado ventral del hígado hacia el corazón usando el hisopo de algodón humedecido en PBS para exponer la superficie visceral y la región hiiar.
- Localice el conducto biliar común que va desde la región hiliar a través del páncreas y hacia el intestino en el esfínter de Oddi (Figura 2Bii, conducto biliar común delineado con la línea punteada amarilla, las puntas de flecha negras apuntan al esfínter de Oddi).
nota: Asegúrese de que el hígado esté húmedo durante todo el procedimiento rociándolo con PBS.
- Limpie el tejido circundante (área ~5 mm) del conducto biliar común con pinzas rectas. Coloque hilo de sutura de seda (tamaño 4-0, 0,17 mm, 3-5 cm de largo) debajo del conducto biliar común (Figura 2Bii) y haga un nudo simple alrededor del conducto biliar común (Figura 2Biii).
nota: Elija un área para el nudo a medio camino entre la región hiliar y el esfínter de Oddi y a cierta distancia de la vena porta para que después de que la sutura se apriete alrededor del conducto biliar común, no interfiera con la inyección de la vena porta.
- Sostenga las tijeras de resorte planas contra el conducto biliar común para hacer una incisión oblicua en el conducto biliar común en el lugar donde el conducto biliar común ingresa al páncreas y al intestino junto al esfínter de Oddi. (Figura 2Biv), la línea punteada amarilla delinea el esfínter de la región de Oddi, enfatizada por puntas de flecha negras).
nota: Este es un paso crucial. Hacer un corte oblicuo y no transversal, y hacer una incisión; No corte el conducto biliar. Cortar todo el conducto biliar hace que la inserción del tubo sea muy difícil.
- Justo antes de usar, mezcle 1 mL de resina amarilla con 50 μL del agente de curado (llenando y vaciando la jeringa de 1 mL) y llene una jeringa Luer de 1 mL con la mezcla de resina y agente de curado.
- Conecte la jeringa llena con el tubo (juego #1). Presione el émbolo para llenar el tubo por completo. Asegúrese de que la mezcla de resina/agente de curado gotee desde la punta del tubo.
nota: Evite y elimine las burbujas en la jeringa y el tubo para obtener mejores resultados.
- Con pinzas, enderece el área alrededor de la incisión del conducto biliar común e inserte el tubo en la abertura del conducto biliar común (Figura 2Bv), con el borde más largo de la punta biselada hacia abajo, hacia el lado dorsal del conducto biliar. Esta orientación asegura que la resina pueda salir por la abertura del tubo, que está hacia arriba, hacia el conducto (Figura 2Bv).
- Apriete el nudo de hilo de seda para asegurar el tubo dentro del conducto biliar común (Figura 2Bvi).
- Inyecta la resina en el conducto biliar común. Observe la vesícula biliar y los lóbulos individuales del hígado.
- Masajea el hígado con un bastoncillo de algodón humedecido en PBS para ayudar a esparcir la resina por igual. Las ramas terminales de los conductos biliares llenos de resina (en ratones de tipo salvaje) son débilmente visibles en la superficie del hígado.
nota: El tiempo esperado para llenar el hígado es de 30 a 100 s.
- Deje de inyectar la resina cuando aparezcan puntos de resina en la superficie del hígado (Figura 2Ci, puntas de flecha azules) o cuando se encuentre resistencia.
nota: Trabaje lo más rápido posible ya que la resina comienza a endurecerse después de agregar el agente de curado de resina. El tiempo de trabajo desde la adición del agente de curado es de aproximadamente 15 min.
- Retira el tubo tirando de él fuera del conducto biliar común y aprieta rápidamente el nudo de seda con pinzas para evitar que la resina se escape. Corta los extremos sueltos de la sutura de seda, para que no interfieran con la inyección de la vena porta.
- Deseche el tubo que contiene resina y la resina restante en los residuos peligrosos y la aguja en los residuos de objetos punzocortantes.
