Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Disección del nódulo sinoauricular (SAN)
- Prepare la solución heparinizada de Complete Tyrode para la disección de RAS.
- Añadir 400 μL de heparina (1.000 USP/mL) a 40 mL de solución de Complete Tyrode y calentar en un baño de agua a 37 °C.
- Inyectar al ratón por vía intraperitoneal 200-300 μL de heparina (1000 USP/mL) y dejar que el animal se siente durante 10 min.
- Eutanasia del ratón heparinizado por sobredosis de isoflurano.
- Coloque el ratón en una pequeña cámara de vidrio que contenga vapores de isoflurano generados al agregar 200-300 μL de isoflurano líquido a un papel de filtro dentro de un tubo de plástico perforado><.
NOTA: Debido a que el isoflurano puede causar irritación de la piel y también puede absorberse a través de la piel, el líquido no debe entrar en contacto directo con el ratón. Por lo tanto, la toallita empapada en isoflurano se coloca en un tubo perforado para su administración.
- Verifica la muerte por el cese del movimiento y del esfuerzo respiratorio y por la ausencia de un reflejo de pinzamiento del dedo del pie. La muerte suele tardar entre 1 y 2 minutos después de la colocación en la cámara
nota: La muerte suele ir acompañada de micción.
- Coloque el ratón en posición supina sobre una tabla de disección con las patas extendidas y fije las patas a la tabla con agujas de jeringa de calibre 23 de 1 pulgada de largo. A continuación, retire el pelaje en las proximidades de la parte inferior de la caja torácica utilizando unas tijeras quirúrgicas y cortando el pelaje de raíz.
nota: Para una tabla de disección, se pueden usar tapas enfriadoras de poliestireno.
- Mientras sostiene la piel con un hemostático, use unas tijeras quirúrgicas para hacer una incisión transversal en la piel justo debajo de la parte inferior de la caja torácica desde aproximadamente el arco costal izquierdo hasta el arco costal derecho (Figura 1A).
- Abra el peritoneo con unas tijeras quirúrgicas y separe cuidadosamente el hígado del diafragma, teniendo cuidado de no cortar el hígado, lo que causará un sangrado excesivo (Figura 1B). Incidir el diafragma a lo largo del tórax para exponer la cavidad torácica (Figura 1C-D).
- Con unas tijeras quirúrgicas, corte las paredes laterales de la caja torácica desde los bordes de los arcos costales hasta las clavículas para exponer el corazón, teniendo cuidado de no dañar el corazón (Figura 1D). Luego, use una aguja de jeringa de calibre 23 para sujetar la caja torácica sobre el hombro, manteniéndola en su lugar y fuera del camino del campo quirúrgico.
- Utilice una pipeta de transferencia para gotear la solución heparinizada heparinizada de Tyrode sobre el corazón para mantenerlo húmedo.
nota: No permita que el corazón se seque.
- Extraiga los pulmones sosteniéndolos con pinzas de Graefe extrafinas y cortando la tráquea con unas tijeras quirúrgicas (Figura 1E).
- Sujete el ápice del corazón con pinzas de Graefe extrafinas y retírelo cortando la aorta y las venas cavas con unas tijeras quirúrgicas. Transfiera el corazón a una placa de Petri que contenga elastómero de silicona curado (Figura 2A) y use una pipeta de transferencia para bañar el corazón con 2-3 mL de solución heparinizada heparinizada completa de Tyrode tibia (37 °C)
nota: Tenga cuidado de no dañar la delicada pared posterior de las aurículas derechas, que contiene la SAN, y las venas auriculares derechas conectadas. Bañar el corazón con la solución de Complete Tyrode evita que el corazón se seque, pero no sumerja completamente el corazón en la solución, ya que afectará la visibilidad durante la disección.
- Oriente el corazón con la aurícula derecha a la derecha del experimentador y la aurícula izquierda a la izquierda del experimentador.
nota: La disección del tejido RAS debe realizarse rápidamente para prevenir lesiones relacionadas con la isquemia.
- Une el vértice del corazón al plato con un alfiler de disección. Luego, mientras sostiene la vena cava inferior con pinzas de laminectomía Dumont # 2, inserte una aguja de jeringa de 22 G a través de la vena cava inferior y superior para ubicar su posición en la aurícula derecha, que también identifica la posición aproximada de la SAN (ubicada en el parche de tejido entre la vena cava inferior y superior (Figura 2B).
- Con pequeños clavos de disección, sujete los apéndices auriculares izquierdo y derecho a la placa.
- Mientras sostiene el apéndice auricular izquierdo con pinzas de laminectomía Dumont #2, coloque un alfiler de disección a través del apéndice auricular izquierdo para mantenerlo en su lugar.
- Mientras sostiene el apéndice auricular derecho con pinzas Dumont # 55, coloque un alfiler de disección a través del apéndice auricular derecho para mantenerlo en su lugar><.
nota: Se puede usar el mismo tipo de fórceps para sujetar los apéndices auriculares izquierdo y derecho si se desea.
- Retire la aguja de la jeringa que se extiende a lo largo de las venas cavas.
- Para liberar sangre del corazón, use las tijeras Castroviejo para extirpar el ápice del corazón (es decir, la mitad inferior) haciendo una incisión transversal a través de los ventrículos (Figura 2C). A continuación, lave el corazón añadiendo la solución heparinizada heparinizada completa de Tyrode tibia (37 °C) con una pipeta de transferencia.
- Utilice las tijeras Castroviejo para cortar a lo largo del tabique auriculoventricular, manteniendo la incisión más cerca del ventrículo que de las aurículas. Continúe cortando a lo largo del tabique auriculoventricular hasta que las aurículas estén separadas de los ventrículos.
- Corte a lo largo del tabique interauricular para extirpar la aurícula izquierda.
- Coloque clavos de disección en la periferia de la aurícula derecha para que quede plana (Figura 2D). Retire cualquier resto de grasa, vasos o tejido de la aurícula con las tijeras Castroviejo.
- Ubique el SAN en la aurícula derecha, que en esta orientación está aproximadamente bordeada por la vena cava superior (en la parte superior), la vena cava inferior (en la parte inferior) y las crestas terminales (a la izquierda) (Figura 2D)
NOTA: La cresta terminal aparece como una cresta muscular oscura entre la orejuela auricular derecha y la SAN. A menudo, también se puede ver la arteria SAN circulando a través de la SAN (Figura 2D).
