Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Preparación de sistemas de infusión con bomba microosmótica
NOTA: Prepare la bomba, el tampón de líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF) y el fármaco (solución de proteína Met-CCL5/RANTES (10 ng/mL en aCSF)) en condiciones estériles utilizando tampones filtrados con filtros de 0,2 μm y realice todos los procedimientos bajo la campana de cultivo con guantes. Los procedimientos quirúrgicos se llevan a cabo de la siguiente manera:
- Prepare las bombas microosmóticas un día antes de la cirugía: Llene la bomba microosmótica cerebral con líquido cefalorraquídeo artificial (LCRa) con una jeringa de 1 ml y una aguja de punta roma junto con el kit. Sumerja la bomba microosmótica en un líquido alimenticio de poliéster y colóquela en un agitador y agite suavemente durante la noche.
PRECAUCIÓN: La bomba debe llenarse con aCSF y se deben evitar las burbujas de aire dentro de la bomba (Figura 1A).
- Antes de iniciar la cirugía, prepare la solución recombinante de proteína Met-CCL5/RANTES (10 ng/mL, diluida en aCSF) que se utilizará en el experimento. Retire el líquido cefalorraquídeo de la bomba y llénela lentamente con la solución del medicamento hasta que se filtre el exceso.
NOTA: 15 mL de solución aCSF o Met-CCL5/RANTES es suficiente para 5-8 bombas.
PRECAUCIÓN: Repita el procedimiento para asegurarse de que la bomba esté completamente llena con el medicamento sin burbujas en su interior.
- Corte los tubos del catéter en la longitud deseada y conéctelos con la aguja de infusión cerebral de extremo romo en el kit de infusión cerebral. Llene el kit de infusión y los tubos con el medicamento.
- Finalmente, ensamble y conecte el kit de infusión cerebral a la bomba microosmótica.
PRECAUCIÓN: No se deben formar burbujas en el tubo ni en la bomba (Figura 1A).
- Sumerja todo el conjunto de fusión entre la bomba osmótica y el cerebro en aCSF en un tubo esterilizado de 50 ml para evitar que la bomba se seque. El set de fusión de bomba osmótica y cerebro ya está listo para ser utilizado para la cirugía.
NOTA: Los sistemas de bombas microosmóticas se pueden utilizar para la infusión de fármacos a largo plazo. Esto garantiza un modo seguro y conveniente de administración de fármacos en el cerebro del ratón.
>2. Cirugía ventricular intracerebral: implantación de la bomba microosmótica
>PRECAUCIÓN: Esterilice el ambiente quirúrgico con etanol al 75% y asegúrese de que las personas involucradas en el estudio usen guantes estériles y una bata de laboratorio limpia. Las herramientas quirúrgicas deben esterilizarse en autoclave y secarse antes de su uso, y posteriormente esterilizarse con etanol al 75% entre cirugías con ratones.
- Pesar el ratón y anestesiarlo mediante inyección intraperitoneal (IP) con Ketamina/Xilacina (Ketamina 50 mg/kg, Xilacina 10 mg/kg).
PRECAUCIÓN: Los ratones con un peso corporal inferior a 24 g no se recomiendan para la cirugía de implantación de bomba osmótica.
- Monte y fije la cabeza del ratón en el aparato estereotáctico (Figura 1B).
- Use un par de tijeras quirúrgicas y pinzas para abrir la piel exterior que cubre el cráneo. Use yodo para limpiar el cráneo periférico.
- Separe la capa más externa de la piel subcutánea con la ayuda de un par de pinzas de cabeza roma cerca de la región del cuello para la implantación del equipo de fusión cerebro-bomba osmótica (Figura 1C).
- Marque el punto de infusión con referencia al mapa cerebral (Figura 1D) utilizando el aparato estereotáctico. En este experimento, la aguja debe implantarse en la3ª región del ventrículo (Bregma: 0,0 mm lateral, 1,3 mm posterior, 5,7 mm ventral).
- Taladre un agujero con un taladro de clavos alrededor del área marcada en el cráneo (Figura 1E).
PRECAUCIÓN: Tenga cuidado de no romper las meninges y los vasos sanguíneos del ratón, evitando así la interrupción de los microvasos sanguíneos en el cerebro.
- Coloque el equipo de fusión microosmótica bomba-cerebro que contiene aCSF (como control) o fármaco (solución de proteína Met-CCL5/RANTES) debajo de la piel detrás de la región del cuello e inserte la aguja de infusión cerebral en el orificio perforado para infundir el fármaco en el cerebro del ratón (Figura 1E). La aguja penetrará en las meninges y penetrará en el ventrículo. Fije la aguja en su lugar en el cráneo con un gel desensibilizante de superficie (Figura 1F) y espere de 1 a 2 minutos hasta que el pegamento se seque. A continuación, corte la parte saliente en la parte superior de la aguja (Figura 1G-H).
- Use un pegamento adhesivo de papel tisú para curar la herida de la operación en la cabeza. Aplique 50 μL del pegamento sobre la herida, junte ambos lados de la piel y manténgala durante 30 segundos para permitir que la piel se selle (Figura 1I).
PRECAUCIÓN: Use una almohadilla con alcohol al 100% para limpiar la herida después de la cirugía y 100 ul de penicilina con estreptomicina para prevenir la infección. NOTA: La piel del ratón formará tejido cicatricial y sanará en unos días después de la administración del pegamento quirúrgico. La principal ventaja del pegamento es que evita los puntos quirúrgicos que pueden causar irritación o inflamación de la piel.
- Coloque el ratón en una jaula limpia mantenida sobre una placa caliente (calentada hasta 37 °C) y espere hasta que el ratón se recupere del efecto anestésico.
PRECAUCIÓN: Es fundamental mantener la temperatura corporal del ratón para mejorar las posibilidades de supervivencia después de la cirugía.
- Después de un período de recuperación de una semana, los ratones estarán listos para otros experimentos, como la prueba de tolerancia oral a la glucosa (OGTT) y la prueba de tolerancia a la insulina (ITT).
