Recolección de ovario intacto de ratón: un procedimiento quirúrgico para aislar ovario completo de un modelo murino

Resumen

Fuente: Mason, J. B. et al. Procedimientos ortotópicos de trasplante de ovario para investigar la influencia de la senescencia ovárica en ratones hembra en la vida y la salud de la vida. J. Vis. Exp. (2018)

En este video, describimos un procedimiento quirúrgico para extraer ovario intacto de un modelo de ratón.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Trasplante de ovarios intactos a ratones envejecidos

NOTA: Este protocolo describe el procedimiento utilizado durante la transferencia de ovarios de un ratón joven (60 días de edad) a una hembra postreproductiva (12 meses de edad) de la misma cepa endogámica. El mismo procedimiento se utiliza para el trasplante de ovario entre dos ratones hembra cualesquiera.

1. Pesar y anestesiar al animal donante mediante inyección intraperitoneal (I.P., aguja de calibre 27), por ejemplo, utilizando un cóctel de ketamina, xilacina y acepromazina (65 mg/kg de ketamina, 13 mg/kg de xilacina 2,0 mg/kg, acepromazina; dosis de cóctel: 6,5 ml/kg). Regrese al animal a la jaula casera climatizada hasta que la anestesia haya hecho efecto.
2. Una vez anestesiado, retire al animal de la jaula de la casa y colóquelo sobre toallas de papel calientes. Usando una maquinilla (preferiblemente la cuchilla #40), retire el pelo unos pocos mm lateral a la línea media a cada lado, comenzando justo debajo de las costillas y moviéndose distalmente, preparando un "parche" recortado de aproximadamente 2-3 cm cuadrado a cada lado del ratón boca abajo dejando una tira de pelo de aproximadamente 1-2 cm que cubra la línea media.
3. Limpie ligeramente las áreas recortadas con etanol al 70% y aplique la solución de betadine en el sitio recortado con un hisopo con punta de algodón.
4. Aplicar gel antibiótico para la protección ocular y administrar meloxicam (2,0 mg/kg) por vía subcutánea (S.C., aguja de 27 ga) en la cara lateral del cuello del animal para el alivio del dolor postoperatorio.
5. Coloque al animal en posición prona sobre un campo quirúrgico estéril y caliente y limpie el área recortada con una gasa de algodón de 2 cm x 2 cm empapada en etanol al 70%.
6. Realice una incisión paralumbar de 1,0 a 1,5 cm y diseccione sin rodeos la piel de la fascia subyacente. Haga otra incisión a través de la fascia. Diseccionar lateralmente por debajo de esta fascia lo más superficialmente posible hasta llegar a la cavidad abdominal
7. Coloque un pequeño paño quirúrgico sobre la incisión (cortado de gasa de 2 cm x 2 cm) y humedezca el paño con solución salina estéril.
8. Con pinzas pequeñas, ubique el tejido adiposo que rodea el ovario en la cavidad abdominal y extraiga suavemente la almohadilla de grasa y el ovario y colóquela sobre el paño de gasa mojado. La almohadilla de grasa ovárica parecerá "más blanca" que el tejido adiposo circundante.
9. Coloque una pinza Bulldog de 1.5 pulgadas en la almohadilla de grasa (teniendo cuidado de no obstruir la bursa ovárica) para mantener el tracto en su lugar durante el procedimiento.
10. Mueva el microscopio de disección en su lugar e identifique claramente la bolsa ovárica. Agarre la bursa con dos pinzas de relojero e incida la bursa ovárica opuesta al hilio ovárico para exponer el ovario. Si el área de acceso prevista de la bursa está muy vascularizada, aplique una gota de epinefrina (1:100.000) con una jeringa en la superficie de la bolsa para reducir el sangrado en el momento del desgarro.
11. Retire suavemente el ovario de la bolsa ovárica y extirpe el ovario sujetando el hilio ovárico con unas pinzas de relojero para evitar el sangrado.
12. Coloque el ovario de la donante en un vidrio lleno de solución salina estéril a 4 °C, cúbralo sin apretar y déjelo a un lado hasta que esté listo para el trasplante.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Microscopio de disección	Cualquier catoscopio de disección con una distancia de trabajo ajustable.
Recirculador de agua tibia y almohadilla apropiada para su campo quirúrgico / de recuperación de tamaño.	Stryker/Gaymar	TP700	Las almohadillas de agua circulante producen campos de operación y recuperación a temperatura uniforme y constante.
Instrumentos quirúrgicos-instrumentos de disección para el acceso al tracto reproductivo			La elección de los instrumentos quirúrgicos específicos depende en gran medida del cirujano
Material de sutura para la bursa ovárica	eSuturas	2809G: 9-0 o 2810G: 10-0 ETHILON NEGRO 5" BV130-5 Taper	La sutura 10-0 puede ser difícil de localizar si se cae en el campo quirúrgico.
Esponja de gelatina reabsorbible	Pfizer	Espuma de gel- PFIZER 09-0315-08	Cortado en trozos pequeños (~2 mm) en condiciones estériles.
Grapas para el cierre de la piel	Becton Dickinson	MikRon Autoclip 9mm (BD 427631)
Ungüento para los ojos.	MWI Suministro Veterinario Co.		Pomada oftálmica estéril Puralube
Jeringas para anestesia, analgesia y epinefrina	MWI Suministro Veterinario Co	BD 305536	27 g x 3/8 pulgadas, bisel intradérmico de 1/2 ml
Jeringas para solución salina.	MWI Suministro Veterinario Co	BD 309657.	Jeringa de 3 ml, punta Luer-Lok, aguja de 27 g
Maquinilla/cuchilla	Andis	Cortacuchillas desmontable inalámbricas Super AGR+ ™ y cuchilla CeramicEdge® #40.	Cualquier cortapelas con una cuchilla fina.
etanol	Suministro de productos químicos de la Universidad		diluir al 70% para su uso.
Solución Betadine	MWI Suministro Veterinario Co.	3233
2x2 almohadillas de gasa	MWI Suministro Veterinario Co.	3073	Esterilizado en autoclave con paquetes de cirugía
Perlas de vidrio de borosilicato	Sigma-Aldrich Co	Z273619	Autoclave en viales de sintilación
4-vinilciclohexeno diepóxido	Sigma-Aldrich Co.	94956