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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
>1. Preparación de ratones e inserción de un catéter en la vena yugular
>NOTA: Aquí, machos o hembras, se utilizaron ratones reporteros mTmG de 5-7 semanas de edad (B6.129(Cg) Gt(ROSA)26Sortm4(ACTBtdTomato,-EGFP)Luo10) cruzados con ratones Pf4-cre, lo que permitió un marcaje de fluorescencia verde intenso en megacariocitos y plaquetas. Antes de comenzar el experimento, precaliente la cámara de calentamiento del microscopio durante unas horas.
- Transporte el ratón a la sala de imágenes y proceda a la anestesia.
- Anestesiar al ratón mediante inyección intraperitoneal (i.p.) de una solución de ketamina (ketamina (100 μg/g) y xilacina (10 μg/g) (5 μL/g).
nota: La administración repetida de ketamina/xilacina se utiliza aquí y funciona bien, pero requiere la interrupción de la grabación para una reinyección regular. Alternativamente, si se dispone de una máquina de anestesia, la inducción de la anestesia puede realizarse con ketamina/xilacina y posteriormente mantenerse bajo inhalación de gases (mezcla de isoflurano, aire y oxígeno).
- Vuelva a colocar al animal en su jaula hasta que alcance la anestesia profunda. Coloque el ratón sobre una placa calefactada a 37 °C para todas las manipulaciones posteriores.
nota: Mientras el animal alcanza la anestesia profunda, encienda el microscopio y todo el equipo y configure los diferentes parámetros necesarios para iniciar el experimento una vez realizada la cirugía. Aquí, el procedimiento dura solo 3 horas y es terminal. El ratón es sacrificado después del experimento sin despertarse. Por lo tanto, la desinfección con etanol para la piel y los instrumentos es suficiente. Sin embargo, dependiendo de las directrices institucionales, o si el procedimiento duraría más tiempo, se deben utilizar métodos de desinfección más completos, como tres exfoliantes alternos con betadine/povidona y alcohol.
2. Instale un catéter en la vena yugular.
>NOTA: Es importante evitar en la medida de lo posible la contaminación microbiana durante la cirugía. Tenga cuidado de desinfectar cuidadosamente la piel con etanol al 70% (EtOH) antes de proceder con la cirugía. Utilice siempre tijeras y pinzas esterilizadas, y enjuáguelas regularmente con 70% de EtOH. Trabaje en un lugar limpio y use una mascarilla. Para la inyección intravenosa se utiliza un catéter de 22 G "sobre la aguja", que consiste en una aguja dentro de un tubo de plástico (consulte la Tabla de materiales).
- Coloque el ratón boca arriba y fije las patas anteriores con cinta quirúrgica para estirar la garganta (Figura 1A). Desinfectar la garganta con etanol al 70%
nota: Para mayor comodidad, se puede afeitar la garganta antes de la cirugía. Si el procedimiento dura más tiempo, se debe realizar un afeitado cuidadoso para una técnica aséptica adecuada.
- Realice una incisión de 0,7-1 cm sobre la vena yugular derecha o izquierda con unas tijeras estériles. Estire el tejido conectivo adyacente para exponer la vena yugular externa y la parte superior del músculo pectoral (Figura 1A).
- Llene el catéter con solución salina fisiológica tibia y estéril. Inserte el catéter en la vena después de penetrar a través del músculo pectoral (Figura 1B).
nota: Tenga cuidado de evitar burbujas de aire dentro del catéter. Es importante insertar el catéter a través del músculo para evitar hemorragias, ya que el músculo formará un punto de compresión. Incluso los ratones con defectos de hemostasia, como los ratones Itgb3-/-, no sangran tras la inserción del catéter con este enfoque.
- Retire suavemente la aguja y, si es necesario, mueva con cuidado el catéter más profundamente en la vena. Conecte la jeringa y estabilice el catéter agregando una gota de pegamento quirúrgico (Tabla de Materiales).
nota: Es posible insertar un catéter dentro de la vena de la cola, aunque requiere algo de práctica porque la vena tiene un calibre más pequeño. Esto es especialmente difícil cuando se utilizan ratones con pelo oscuro, cuya vena de la cola es apenas visible. Debido a su mayor calibre, la colocación del catéter dentro de la vena yugular puede permitir inyectar volúmenes más grandes o tratamientos repetidos de manera más confiable. Tenga en cuenta que la jeringa se llena por primera vez con solución salina tibia y no olvide inyectar el volumen muerto antes de inyectar la solución del medicamento.
- Vuelva a colocar el ratón en posición prona (Figura 1C). Aplicar gel (Tabla de Materiales) en los ojos para prevenir la sequedad.
