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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Cirugía e instalación del anillo craneal
>NOTA: El soporte completo para la instalación del ratón consta de 4 piezas, un bloque y una placa, el anillo para sujetar la cabeza del ratón y un tornillo para fijar el anillo al bloque (Figura 1A). Todos los elementos del soporte se han obtenido a partir de i.materialise.com mediante impresión 3D. La placa está hecha de polímero de acrilonitrilo butadieno estireno (ABS), el bloque y el tornillo de acero inoxidable y el anillo de acero inoxidable de alta calidad (acero inoxidable de alto detalle) (consulte la Figura 2 para conocer las dimensiones y los materiales de los archivos de impresión 3D). El bloque se fija de forma permanente al soporte, ya sea atornillado o pegado. Una vez que el anillo está fijado en el cráneo del ratón, debe atornillarse al soporte del bloque (Figura 1A).
- Humedecer el cabello del cuero cabelludo con una toalla de papel humedecida con etanol al 70% para la desinfección. Retire todo el cabello suelto con una toalla de papel húmeda.
nota: Para mayor comodidad, se puede afeitar el cuero cabelludo antes de la cirugía.
- Incidir el cuero cabelludo formando una T en la línea media hasta 1 cm y entre las orejas para exponer la pantorrilla con tijeras finas estériles y pinzas.
nota: El anillo se colocará de manera que se superponga a los huesos frontal y parietal (Figura 1B).
- Use pinzas estériles para exponer el cráneo. Retire con cuidado el periostio con tijeras y pinzas. Utilice un hisopo de algodón estéril empapado con solución salina fisiológica para eliminar todo el periostio y cualquier residuo o pelo, que podría alterar las imágenes.
nota: Para limitar las reacciones inflamatorias, tenga mucho cuidado de no dañar el hueso.
- Elimine cualquier rastro de sangre enjuagando con solución salina y seque rápidamente el hueso con un hisopo de algodón seco. Aplique el gel de pegamento al anillo, colóquelo sobre el hueso expuesto y manténgalo durante unos segundos para que el anillo quede firmemente unido al cráneo><.
nota: No debe entrar pegamento en el campo de observación, ya que puede provocar una autofluorescencia indeseable.
- Humedecer ligeramente el cráneo con un bastoncillo de algodón sumergido en solución salina fisiológica.
- Prepare la pasta dental de silicona mezclando cuidadosamente los componentes azules y amarillos 1:1. Aplique pasta dental alrededor del anillo para sellar y evitar fugas durante la toma de imágenes. Retire con cuidado cualquier pasta o pegamento dental que pueda haber entrado en el anillo.
- Llene el anillo con solución salina y compruebe si hay fugas.
nota: La solución salina sirve como medio de inmersión para el objetivo del microscopio. El sangrado puede ser más crítico cuando se utilizan ratones con defectos relacionados con la hemostasia. Es esencial evitar que la sangre entre en el anillo, ya que puede difuminar más imágenes.
- Coloque el mouse en el soporte y atornille el anillo en el soporte del bloque (Figura 1C). Coloque compresas dobladas debajo de la cabeza del animal para levantar la cabeza y evitar que el anillo se desprenda del cráneo.
nota: La cabeza se fija directamente para que impida los movimientos de la imagen debido a la respiración.
- Coloque el soporte y el conjunto del ratón en la cámara del microscopio calentada (Figura 1D).
NOTA: Tenga cuidado de no desalojar el catéter insertado en ningún momento.
