Imágenes intravitales: un método para la observación a nivel celular del páncreas de ratón a través de una ventana de imagen estabilizada

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Imágenes intravitales

1. Encienda el microscopio intravital, incluida la potencia del láser.
2. Encienda la almohadilla térmica y ajuste la regulación homeotérmica a 37 °C.
   nota: Alternativamente, use una almohadilla térmica pasiva o una lámpara con control frecuente si no hay regulación homeotérmica.
3. Tomemos como ejemplo un ratón con ventana pancreática preimplantada. Realizar anestesia intramuscular con una mezcla de tiletamina/zolazepam (30 mg/kg) y xilacina (10 mg/kg).
   nota: Se recomienda el uso de tiletamina/zolazepam en lugar de ketamina debido a su efecto adverso de hiperglucemia. Se debe seleccionar la anestesia óptima para el propósito de los experimentos.
4. Inserte un catéter vascular para la inyección.
   1. Aplique presión en el lado proximal de la cola con el dedo índice y el tercer dedo como alternativa a la aplicación de un torniquete. Calienta la cola con una lámpara si es necesario.
   2. Esterilizar la vena de la cola con un spray de etanol al 70%.
   3. Inserte un catéter de 30 G en la vena lateral de la cola. La regurgitación de sangre se visualizará en el tubo de PE10.
   4. Aplique una cinta de seda en el catéter para estabilizarlo.
   5. Inyecte FITC/TMR dextrano u otras sondas fluorescentes (25 μg de anti-CD31 conjugado con Alexa 647), según corresponda, de acuerdo con la combinación de sondas fluorescentes.
      nota: En el caso de las sondas fluorescentes de anticuerpos conjugados, inyectar 2 horas antes de la sesión de imagen.
5. Transfiera el ratón de la plataforma quirúrgica a la etapa de imagen.
6. Inserte una sonda rectal para controlar automáticamente la temperatura corporal con el sistema de almohadillas térmicas homeotérmicas.
7. Inserte la ventana de imagen pancreática en el soporte de ventana preparado durante la configuración de la microscopía intravital (Figura 1). Para un microscopio invertido, es posible que no se requiera un soporte de ventana.
8. Realizar imágenes intravitales.
   1. Para obtener imágenes del páncreas, comience con una lente objetivo de bajo aumento (p. ej., 4x) para escanear la vista completa del páncreas en la ventana de imágenes pancreáticas (campo de visión recomendado: 2500 x 2500 μm).
   2. Después de determinar la región de interés, cambie a una lente objetivo de mayor aumento (20x o 40x) para realizar la obtención de imágenes a nivel celular (campo de visión recomendado: 500 x 500 μm o 250 x 250 μm). En este experimento, la resolución lateral y axial fue de aproximadamente 0,5 μm y 3 μm, respectivamente.
   3. Realice imágenes de pila z o de lapso de tiempo para observar la estructura 3D o la dinámica a nivel celular, como la migración celular.
      nota: Para obtener imágenes de las células que expresan proteínas fluorescentes de animales transgénicos (MIP-GFP), se toleraron 30 s de exposición láser intermitente de 488 nm con una potencia de hasta 0,43 mW sin fotoblanqueo ni daño tisular notables. Para obtener imágenes de las proteínas fluorescentes marcadas con Alexa 647, la potencia del láser de 640 nm de hasta 0,17 mW fue tolerable sin fotoblanqueo notable ni daño tisular. La exposición prolongada al láser de excitación con una potencia superior a este ajuste puede provocar fotoblanqueo o daño tisular por fototoxicidad. Ajuste la ganancia y la potencia adecuadas para obtener una imagen adecuada de la región de interés. El ajuste detallado de los parámetros en la microscopía intravital debe ser individualizado para cada microscopía intravital preparada en el instituto.

Figura 1: Fotografía de la implementación de la ventana de imagen intravital pancreática.Se implanta una ventana de imagen pancreática intravital en el ratón en la etapa traslacional XYZ y el soporte de la cámara de imagen conectado a la montura basculante se conecta a la ventana de imagen pancreática. Derechos de autor 2020 Asociación Coreana de Diabetes de Diabetes Metab J. 2020 44:1:193-198. Reimpreso con permiso de la Asociación Coreana de Diabetes.