Modelo de perfusión anterógrada: una técnica ex vivo para perfundir corazón de ratón aislado

Resumen

Fuente: Omatsu-Kanbe, M. et al., Un método de perfusión anterógrada para el aislamiento de cardiomiocitos de ratones. J. Vis. Exp. (2021).

Este video describe una técnica de perfusión anterógrada de un corazón de ratón aislado durante la cual se inyecta una perfusión a través del ventrículo izquierdo y, finalmente, perfunde todo el miocardio. Este método se puede utilizar para aislar cardiomiocitos de modelos murinos y generar corazones descelularizados para aplicaciones posteriores.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Perfusión anterógrada del corazón del ratón

NOTA: La pipeta de transferencia de plástico utilizada para succionar el corazón debe ser blanda y no estar afilada bruscamente hacia la punta. Elija una pinza vascular pequeña con dentado. Los instrumentos recomendados se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Extirpación del corazón del ratón y pinzamiento de la aorta
   nota: Los ratones adultos (>8 semanas de edad) deben ser sacrificados mediante una sobredosis de pentobarbital sódico (>300 mg/kg, inyección intraperitoneal [i.p.]) con heparina (8000 unidades/kg).
   1. Extirpe el corazón del ratón rápidamente chupando.
      1. Abra la cavidad torácica rápidamente para exponer el corazón. Corte la pipeta de transferencia de plástico, cuya punta es aproximadamente del mismo tamaño o ligeramente más pequeña que el corazón expuesto (generalmente en un sitio de aproximadamente 1 cm desde la marca de 0,5 ml hacia la punta, pero depende del tamaño del corazón).
      2. Succionar el corazón en la pipeta, levantar la pipeta para crear suficiente espacio para insertar las tijeras y extirpar el corazón con tijeras curvas desde el lado dorsal, evitando dañar las aurículas.
      3. Transfiera inmediatamente el corazón extirpado al vaso de vidrio de 30 ml que contiene CIB-EGTA enfriado con hielo para detener la contracción. Este procedimiento suele durar <1 min.
   2. Limpieza alrededor de la aorta
      1. Transfiera el corazón a una placa de cultivo de 35 mm llena de CIB-EGTA enfriado con hielo y extraiga el pulmón y otros tejidos visibles, y luego transfiera el corazón limpiado en trozos grandes al soporte cardíaco lleno de CIB-EGTA enfriado y colóquelo con el ápice hacia abajo.
      2. Bajo el microscopio estereoscópico, extraiga la grasa y los tejidos conectivos para limpiar alrededor de la aorta. Si la longitud de la aorta cortada es demasiado larga, incluyendo la arteria braquiocefálica, la arteria carótida común izquierda o la arteria subclavia izquierda, corte la aorta justo debajo de la arteria braquiocefálica para acortarla y así continuar con el siguiente paso. Este procedimiento suele durar aproximadamente 4 minutos
   3. Pinzamiento de la aorta y colocación del corazón pinzado en la placa de perfusión
      1. Inserte la aguja de inyección e inicie la perfusión para descargar la sangre
         1. Bajo el microscopio, coloque el corazón en el soporte para el corazón. El operador debe mirar hacia la superficie anterior del corazón, levantar el extremo de la aorta con pinzas y sujetar la aorta cerca de las aurículas con una pequeña pinza vascular mientras empuja suavemente la aorta hacia abajo.
         2. Coloque el corazón pinzado en la placa de perfusión con la cara anterior hacia arriba y luego cúbralo con unas gotas de CIB-EGTA para evitar que se seque. Este procedimiento suele durar <20 s.
      2. Perfusión anterógrada del corazón
         nota: Primero, perfunda el corazón con CIB-EGTA para descargar la sangre y prevenir la coagulación.
         1. Inserte la aguja de inyección e inicie la perfusión para descargar la sangre
            1. Coloque la jeringa de 20 ml llena de CIB-EGTA precalentado conectada al tubo de extensión flexible y a una aguja de inyección marcada en la bomba de infusión. Ponga en marcha la bomba a una velocidad lenta de 0,5 mL/min para llenar cuidadosamente la aguja y el tubo con CIB-EGTA y asegúrese de evitar que entre aire en el tubo.
            2. Coloque la aguja de inyección en la placa de perfusión con el lado más corto de la forma diagonal al frente. Deslice la aguja hacia el ápice del corazón hasta que lo toque y, a continuación, inserte con cuidado la aguja cerca del ápice del ventrículo izquierdo en la cámara ventricular sin retorcerla. No separe la aguja de la placa mientras realiza la inserción.
            3. Observe la marca roja para estimar la profundidad de la inserción de la aguja. Cuando se completa la inserción de la aguja, la sangre que fluye desde la arteria coronaria debe comenzar a descargarse.
            4. Fije la aguja de inyección en la placa con cinta adhesiva y aumente la velocidad de la bomba a 1 mL/min. Este procedimiento suele durar aproximadamente 30 s. Si el corazón se perfunde con éxito, el flujo de CIB-EGTA en el capilar justo debajo del epicardio se puede ver bajo el microscopio.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubo de extensión	Arriba, Japón	X1-50	Conéctelo con la jeringa y la aguja de inyección para la perfusión anterógrada.
Alfombrilla calefactora	Natsume Seisakusho, Japón	KN-475-3-40	Equipo para calentar la placa de perfusión.
Bomba de infusión	TERUMO, Japón	TE-311	Bomba de jeringa de infusión para perfusión anterógrada.
Aguja de inyección (calibre 27)	TERUMO, Japón	NN-2719S	Aguja para la inserción en el ventrículo izquierdo.
Insulina (del páncreas bovino)	Sigma-Aldrich, Estados Unidos	I5500	Disolver en 0,1 m de HCl.
Jeringa de plástico (20 mL)	TERUMO, Japón	SS-20ES	Úselo para infusión de CIB-EGTA.
Pinza vascular	Karl Hammacher GmbH, Alemania	HSE 004-35	Pinza vascular pequeña y recta que se utiliza para pinzar la aorta.
Todos los demás reactivos	Nacalai Tesque, Japón