Fijación de la presión de la válvula pulmonar murina aislada: un procedimiento para aislar y fijar químicamente la válvula pulmonar de ratón en conformación cerrada

Resumen

Fuente: Liu, Y., et al. Cirugía y procesamiento de muestras para la obtención de imágenes correlativas de la válvula pulmonar murina. J. Vis. Exp. (2021)

En este video, describimos el procedimiento para aislar y fijar químicamente el valor pulmonar del ratón en conformación cerrada mediante presurización por perfusión.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Escisión de la válvula pulmonar

1. Autoclave las herramientas necesarias para la disección del ratón. Esto incluye tijeras finas, micro pinzas, micro pinzas vasculares, pinzas de aplicación de abrazaderas, soportes de microagujas, tijeras de resorte y retractores.
2. Aclimatar a todos los ratones durante un mínimo de 2 semanas antes de la operación. Retire los ratones C57BL/6, de aproximadamente 1 año de edad, de sus jaulas y péselo, luego eutanasique con una sobredosis de cóctel de ketamina/xilacina (ketamina:xilacina 3:1, 0,01 ml por g).
3. Coloque el ratón en posición de decúbito dorsal sobre una bandeja y asegure sus extremidades con cinta adhesiva. Una vez asegurado, realice la toracotomía.
   1. Exponga el corazón eliminando el exceso de tejido adiposo y fascia.
   2. Extirpar la aurícula derecha y perfundir a través del ventrículo izquierdo con solución salina a temperatura ambiente (NaCl al 0,9%). La perfusión debe tomar aproximadamente 20 mL durante 30 s. Esto da como resultado la exanguinación del ratón.
4. Se extirpa todo el corazón cortando la vena cava superior, la vena cava inferior, la arteria pulmonar y la aorta. Se debe tener especial cuidado con la arteria pulmonar. Corte aproximadamente 2 mm por encima de la unión ventrículo-arterial, ya que esto servirá como conducto para la presurización.
5. Extirpar los ventrículos izquierdo y derecho para exponer las cámaras a la presión atmosférica. Asegúrese de que la estructura del tronco pulmonar no se vea afectada por la extirpación de los ventrículos.

>2. Fijación de la presión de la válvula pulmonar

1. Tubo de presurización anastomosa con arteria pulmonar, dejando aproximadamente 1 mm de distancia entre la unión sinotubular y el extremo del tubo para acomodar grandes movimientos de las valvas y el tronco pulmonar.
2. Eleve el depósito a una presión fisiológica análoga y llénelo con la solución salina. Pruebe el sistema de flujo para asegurarse de que no haya obstrucciones ni burbujas de aire.
3. Conecte una llave de paso a la válvula pulmonar anastomosada y asegure un flujo adecuado a través del tubo (es decir, sin burbujas de aire) cambiando el tracto de salida. Una vez que el flujo es adecuado, cambiar el flujo de salida a la válvula pulmonar anastomosada y asegurar la presurización del tronco pulmonar. Esto se identifica por la distensión del tronco pulmonar.
4. Una vez confirmada la presurización del tronco pulmonar, incorporar gradualmente solución fijadora primaria (glutaraldehído al 1,25%, paraformaldehído al 1,0% en cacodilato 0,15 M) hasta purgar la solución salina. Esto se hace eliminando una porción, aproximadamente el 25% de la capacidad del depósito, de la solución salina y reemplazándola con el fijador primario.
   cautela: Los fijadores utilizados (paraformaldehído y glutaraldehído) son altamente tóxicos y se debe usar un equipo de protección personal (EPP) adecuado para garantizar la seguridad.
5. Coloque una gasa empapada en fijador sobre la muestra de tejido para evitar que se seque.
6. Perfunda el fijador durante 3 h, rellenando el depósito según sea necesario para mantener una presión constante. A lo largo de la fijación, no es raro que la válvula pulmonar se encoja debido a la fijación química. Si este es el caso, reponga constantemente el depósito con fijador primario para mantener la presión fisiológica.
7. Almacene la válvula cardíaca en la solución fijadora a 4 °C hasta su uso. Las muestras se almacenaron hasta 1 semana sin ninguna diferencia perceptible.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
25% glutaraldehído (aq)	ems	16210	Componente fijador primario
Inyección de cloruro de sodio al 0,9%	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-10
Jeringa de 1 ml	Bd	309659
Jeringa de 10 mL	Bd	309604
Aguja de 22G	Bd	305156
Llave de paso de 3 vías	Smiths Medical ASD, Inc	MX5311L
4% de paraformaldehído (AQ)	ems	157-4-100	Componente fijador primario
Ratones C57BL/6	Laboratorios Jackson	664	Aproximadamente 1 año
Pinza de aplicación	FST	00072-14
Pinza Dumont #5	FST	11251-20
Pinzas Dumont #5/45	FST	11251-35
Pinza fina Dumont #7	FST	11274-20
Tijera fina	FST	14028-10
Solución salina (cloruro de sodio estéril al 0,9%)	Hospira Inc	NDC 0409-0138-22
Microscopio quirúrgico	Leica	M80
Portaagujas/pinzas Tish	Micrinas	MI1540
Cortapatillas	Wahl	9854-500
Sutura monofilamento de poliamida negra, 10-0	Corporación de instrumentos AROSúrgicos	TI38402
Sutura monofilamento de poliamida negra, 6-0	Corporación de instrumentos AROSúrgicos	SN-1956
Inyección de clorhidrato de ketamina	Hospira Inc	NDC 0409-2053
Ácido L-aspártico	Sigma-Aldrich	56-84-8	Componente de tinción
Nitrato de plomo	ems	Año 17900	Componente de tinción
Cacodilato de sodio trihidrato	Sigma-Aldrich	6131-99-3	búfer
Canciones no tejidas	Corporación McKesson.	94442000
Pinza de micro-adson	FST	11018-12
Filtro Millex-GP, 0,22 mmm, PES 33 mm, no estéril	EMD Millipore	SLGP033NS