Colección de depósito de tejido adiposo blanco y marrón de un cachorro de ratón: un procedimiento quirúrgico para recolectar el tejido adiposo blanco y el tejido adiposo marrón de un cachorro de ratón

En este artículo

Resumen

Fuente: Galmozzi, A. et al. Aislamiento y diferenciación de preadipocitos primarios blancos y marrones de ratones recién nacidos. J. Vis. Exp. (2021)

En este video, demostramos el procedimiento quirúrgico para aislar el tejido adiposo blanco subcutáneo y el tejido adiposo marrón interescapular de un ratón recién nacido.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Recolección y digestión de depósitos adiposos (día 1)

Prepare dos tubos de 1,5 ml para cada cachorro: uno para el tejido adiposo marrón (BAT) y otro para el tejido adiposo blanco (WAT). Añadir 250 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) + 200 μL de tampón de aislamiento 2x (123 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 1,3 mM de CaCl₂, 5 mM de glucosa, 100 mM de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico (HEPES), penicilina-estreptomicina y 4% de albúmina sérica bovina libre de ácidos grasos) a cada tubo. Mantenga las soluciones estériles y en hielo.
Coloque a los cachorros en cámaras pequeñas (por ejemplo, un pocillo de un plato de 6 pocillos) y colóquelos en hielo hasta que adquieran hipotermia. Asegúrate de que no haya contacto directo entre los cachorros y el hielo. Pinchar una pata con una punta para asegurar la pérdida de conciencia y sacrificar a los cachorros por decapitación con tijeras afiladas.
NOTA: si trabaja con diferentes genotipos, prepare un tubo adicional para recoger una biopsia de cola (corte de 3 mm) para el genotipado. Si el genotipado se realiza de inmediato, mantenga a los cachorros sacrificados en hielo hasta la disección para recolectar depósitos adiposos.
Calcule y pese la cantidad de colagenasa necesaria para digerir todos los depósitos. Añadir 50 μL de colagenasa tipo I de 15 mg/mL en tampón de aislamiento 2x a cada tubo. No vuelva a suspender la colagenasa en un tampón de aislamiento hasta que se hayan recogido todos los tejidos.
Para recolectar el WAT subcutáneo, corte la piel alrededor del abdomen del cachorro (evite la ruptura peritoneal) y tire suavemente de la piel hacia abajo por debajo de las patas. Sin tomar la piel, recoja cuidadosamente el depósito de grasa, que aparecerá como un tejido transparente (P1 o más joven) o blanco (P2 y más viejo), delgado y alargado adherido en el interior o en la parte superior del cuádriceps (Figura 1A, B). Enjuague el depósito de grasa en PBS y colóquelo en uno de los tubos que contienen 250 μL de PBS + 200 μL de tampón de aislamiento 2x. Mantener en hielo.
NOTA: Los ratones P0 y P1 dan el mejor rendimiento. En las crías P0-1, el depósito subcutáneo de WAT es casi transparente. En los ratones P2 y mayores, el depósito es más fácil de identificar porque ya se está volviendo blanco, lo que indica la presencia de adipocitos blancos completamente maduros, cargados de lípidos.
Para recoger el BAT interescapular, tire de la piel de los omóplatos sobre la cabeza. Levante el BAT, el tejido de color rojo intenso entre los omóplatos, y haga incisiones cuidadosamente alrededor de él para separarlo del cuerpo (Figura 1A, B). Verifique la consistencia y el color; enjuague con PBS; colóquelo en el otro tubo que contiene 250 μL de PBS + 200 μL de tampón de aislamiento 2x; y mantener en hielo.
NOTA: Al recolectar BAT de ratones P2 y mayores, retire con cuidado el tejido adiposo blanco que rodea el BAT. Consiste en una lámina delgada, suave y blanca de adipocitos ubicada entre la piel y el BAT, que es más profunda entre los omóplatos.

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Resultados

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Figura 1: Recolección y procesamiento de almohadillas de grasa. (A) Representación esquemática del aislamiento primario de adipocitos blancos (arriba) y marrones (abajo). (B) Depósitos adiposos subcutáneos blancos (arriba) y marrones (abajo). En los ratones P0, el WAT subcutáneo es casi invisible, pero se distingue el ~día 2 después del nacimiento. Por el contrario, ...