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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Preparación del material y los instrumentos
- Conecte la manta térmica para mantener la temperatura del área de operación y la temperatura corporal del ratón durante la anestesia a 37 °C.
- Tijeras y pinzas de autoclave, prepare una solución de etanol al 70% y tenga a mano el ungüento oftalmológico de dexpantenol, varias piezas de algodón y la sutura de poliéster trenzado recubierta 5-0 listas para usar. Prepare una jeringa de 1 mL con solución salina al 0,9% (sin aguja) para mantener hidratado el sitio de la incisión del animal. Preparar el gas anestésico (100%O2 + isoflurano).
- Prepare un soporte para la sonda láser Doppler cortando la punta de una punta de pipeta de 10 μL (3-5 mm de longitud).|
NOTA: Todos los instrumentos se esterilizan con un esterilizador de perlas calientes. Las superficies también se desinfectan antes y después de la cirugía con un spray desinfectante microbiano. Antes de la cirugía, las áreas que rodean la cabeza y el pecho de los ratones se desinfectan con un spray desinfectante de heridas.
>2. Preparación del láser Doppler
- Inyectar analgesia al ratón 30 min antes de la cirugía (4 mg/kg de carprofeno y 0,1 mg/kg de buprenorfina, por vía intraperitoneal).
- Anestesiar al ratón colocándolo en la cámara de inducción con un caudal de isoflurano del 4% hasta el cese del movimiento corporal espontáneo y de las vibrisas.
- Coloque el ratón en posición prona en el área de operación con la nariz en la máscara de anestesia. Mantenga la concentración de isoflurano al 4% durante un minuto más, luego redúzcala y manténgala al 2%.
- Ajuste la almohadilla térmica controlada por retroalimentación asociada para mantener la temperatura corporal del ratón a 37 °C e inserte suavemente la sonda rectal para controlar la temperatura durante los procedimientos quirúrgicos.
- Aplique el ungüento oftálmico de dexpantenol en ambos ojos.
- Desinfecte la piel y el vello que rodea el ojo y la oreja izquierdos con etanol al 70%.
- Corta el cuero cabelludo entre la oreja izquierda y el ojo (1 cm de largo) para exponer el hueso del cráneo.
- Corta y retira el músculo temporal para visualizar el MCA debajo del cráneo.
- Fije con pegamento la parte exterior de la punta que sujeta la sonda/fibra láser Doppler en la parte superior del MCA izquierdo con pegamento. Luego, pegue la piel para cerrar la herida alrededor del soporte de la punta. Aplique 2-3 gotas de pegamento endurecedor para acelerar el proceso. Asegúrese de que la fibra láser Doppler no esté pegada y se pueda quitar fácilmente del soporte de la punta en cualquier momento.
3.Modelo MCAo transitorio (oclusión)
- Gire el ratón a la posición supina. Coloque el hocico en el cono de anestesia y fije las patas con cinta adhesiva.
- Desinfecte la piel y el vello que rodea el tórax y haga una incisión de 2 cm de largo en la línea media del cuello.
- Use fórceps para separar la piel y las glándulas submandibulares. Use retractores para sujetar el músculo esternomastoideo, exponer el campo quirúrgico y encontrar la arteria carótida común izquierda (CCA). Diseccionar el ACC libre de tejido conectivo y nervios circundantes (sin dañar el nervio vago) y realizar una ligadura transitoria antes de la bifurcación.
- Diseccionar la arteria carótida externa (ECA) y hacer un nudo permanente en la parte visible más distal, colocando otra sutura debajo de la ECA, cerca de la bifurcación, y preparar un nudo suelto para utilizarlo posteriormente.
- Diseccionar la arteria carótida interna (ACI) y colocar una pinza microvascular sobre ella, 5 mm sobre la bifurcación. Asegúrese de no dañar el nervio vago.
- Haz un pequeño agujero en el ECA entre las ligaduras ajustadas y las sueltas; ten cuidado de no cortar todo el ECA.
- Introduce el filamento y hazlo avanzar hacia el CCA. Apriete la ligadura suelta en el ECA alrededor del lumen para asegurar brevemente el filamento en esa posición y evitar sangrado al retirar el clip microvascular.
- Retire la pinza microvascular e inserte el filamento a través del ICA hasta llegar al origen del ACM mediante la detección de una reducción brusca (>80%) en el flujo sanguíneo cerebral medido por el láser Doppler. Fije el filamento en esta posición apretando aún más el nudo alrededor del ECA.
nota: Cuando el filamento va hacia la dirección adecuada, avanza suavemente y no se debe observar resistencia.
- Registre los valores de Doppler láser antes y después de la inserción del filamento.
- Retire el retractor y reubique el músculo esternomastoideo y las glándulas submandibulares antes de suturar la herida. Retire la sonda láser Doppler y coloque el animal en una cámara de recuperación a 37 °C durante 1 h (hasta la extracción del filamento).