Modelo de asa ileal de ratón: un modelo quirúrgico para estudiar la permeabilidad intestinal en el ratón

Resumen

Fuente: Boerner, K., et al. Evaluación funcional de la permeabilidad intestinal y la migración transepitelial de neutrófilos en ratones utilizando un modelo de bucle intestinal estandarizado. J. Vis. Exp. (2021)

Este video muestra la generación de un modelo de bucle ileal para estudiar la permeabilidad intestinal en un modelo de ratón. Este método proporciona un modelo vivo para comprender la función de la barrera epitelial y la consiguiente respuesta inmunitaria.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Generación del bucle ileal

1. Preparación de la piel: Frote el pelaje de la línea media abdominal con hisopos con alcohol o una esponja de gasa empapada con etanol al 70%. No moje un área amplia de pelaje con alcohol para prevenir la hipotermia.
2. Con unas tijeras, realice una laparotomía de línea media. Realice una incisión vertical en el centro del abdomen (de unos 2 cm de longitud) y exponga el peritoneo. Tenga cuidado de no lesionar los órganos intraabdominales.
3. Coloque una gasa de algodón húmeda precortada sobre la cavidad intraabdominal expuesta.
4. Utilice bastoncillos de algodón húmedos para movilizar y exteriorizar el ciego. Coloque con cuidado el ciego sobre la gasa de algodón húmeda.
   nota: El ciego se localiza en el cuadrante caudal izquierdo de la cavidad abdominal en la mayoría de los ratones, independientemente del sexo del animal.
5. Utilice hisopos de algodón húmedos para movilizar y exteriorizar suavemente el íleon cuya sección terminal (extremo distal) está unida al ciego (Figura 1B).
6. Despliega al menos 6 cm de íleon terminal sobre la gasa de algodón húmeda sin interrumpir los vasos mesentéricos y el suministro de sangre. El riego sanguíneo se mantiene si no hay sangrado y el tejido mantiene su color rosado (Figura 1B)
   nota: Evite secar los tejidos expuestos manteniendo los tejidos húmedos todo el tiempo con HBSS tibio (cada 2 a 3 minutos) usando una jeringa de 10 ml preconectada a un tubo de alimentación amarillo.
7. Cerca del ciego, identifique la arteria principal del mesenterio que suministra sangre al íleon. A continuación, localice dos sitios de ligadura en el mesenterio que estén libres de vasos sanguíneos críticos.
8. Con ayuda de pinzas de tejido romo, agarre firmemente el íleon terminal (el más cercano al ciego) y, con pinzas de punta fina, fenestre el mesenterio evitando los vasos sanguíneos. Coloque una sutura de seda a lo largo de la perforación y haga un nudo quirúrgico para crear la primera ligadura (extremo distal del bucle).
9. Utilice la regla para medir 4 cm de distancia de la primera ligadura y cree la segunda ligadura (extremo proximal del bucle) como se menciona en el paso 2.8 (Figura 1C).
10. Con unas tijeras finas se corta cuidadosamente al lado de cada ligadura para aislar el asa ileal de 4 cm, manteniendo intacto el riego sanguíneo y la membrana mesentérica.
    nota: Corte ambos extremos del segmento exteriorizado del iLoop, luego enjuague suavemente como un paso necesario para evitar la interferencia con el contenido luminal (materia fecal), facilitando así la dispersión uniforme de FITC-dextrano o estímulos quimiotácticos a lo largo de toda la longitud del segmento aislado, además de permitir una cuantificación más precisa de los leucocitos mediante citometría de flujo. Este procedimiento también permite una distensión uniforme de la mucosa después de la inyección de volúmenes específicos de reactivo y una mejor reproducibilidad entre animales.
11. Enjuague suavemente el contenido del segmento del asa ileal con HBSS tibio utilizando un tubo de alimentación amarillo flexible conectado a una jeringa de 10 ml.
12. Lime los dos extremos cortados del asa ileal enjuagada con sutura de seda.
13. Utilice una jeringa de 1 ml con aguja de 30 g para inyectar lentamente 250 μl de reactivo como FITC-dextrano o quimiocina en la luz intestinal. El asa ileal se inflará provocando una distensión moderada de la mucosa (Figura 1D).
    nota: Inyecte el reactivo en la luz del asa en el lado opuesto de la arteria mesentérica. Tenga cuidado de no sacar el asa ileal del animal mientras se inyecta para evitar desgarrar los vasos sanguíneos e inducir sangrado.
14. Con hisopos de algodón húmedos, vuelva a colocar suavemente el asa ileal, el íleon proximal y el ciego.
15. Utilice un portaagujas, pinzas anatómicas y suturas de seda 3.0 no absorbibles con aguja de corte inverso para cerrar la pared abdominal.
16. Coloque al animal en una cámara de anestesia con temperatura regulada durante el período de incubación.

Resultados

Figura 1: El modelo de bucle ileal. (A) Resumen esquemático del modelo de bucle ileal. La laparotomía mediana se realiza en ratones bajo anestesia y se coloca en una tabla de cirugía con temperatura controlada. (B) Exteriorización del ciego (*), íleon y mesenterio. Se identifican dos sitios adecuados para la ligadura (1,2). (C) Aislar un segmento de 4 cm de longitud: la primera ligadura (1) se coloca...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Equipo y material
Hisopos con alcohol BD	Bd	326895
Aguja BD PrecisionGlide, 25G x 5/8"	Bd	305122
Aguja BD PrecisionGlide, 30G x 1/2"	Bd	305106
BD 1ml Jeringa de Tuberculina Sin Aguja	Bd	309659
Tubo de centrífuga de 15 ml	Corning	14-959-53A
Microplaca de poliestireno negro sólido de 96 pocillos de Corning	PescadorCientífico	07-200-592
Plato de cultivo sin tratar Corning, 10 cm	MilliporeSigma	CLS430588
Aplicador de punta de algodón (bastoncillo de algodón), 6", estéril	PescadorCientífico	25806 2WC
Esponjas de gasa rellenas de algodón Dynarex, no estériles, 2" x 2"	Medex	3249-1
Vaporizador de anestesia EZ-7000 (Sistema Clásico, incluyendo unidades de calentamiento)	Sistemas E-Z	EZ-7000
Tijeras finas Moria	FST	14370-22
Puralube Vet Pomada, Lubricante Ocular Estéril	Dechra	12920060
Pinzas de anillo (pinzas de tejido romo)	FST	11103-09
Roboz Surgical 4-0 Seda Negro Trenzado, 100 YARDAS	PescadorCientífico	NC9452680
Pinzas Semken (pinzas anatómicas)	FST	Artículo 1108-13
Sofsilk Sutura Negra Recubierta No Absorbible Seda Trenzada Tamaño 3-0, 18", Aguja 19mm de longitud 3/8 círculo Corte inverso	HenrySchein	SS694
Pinzas finas para estudiantes, en ángulo	FST	91110-10
Jeringa de 10 ml PP/PE sin aguja	Millipore Sigma	Z248029
Tubos de alimentación amarillos para roedores 20G x 30 mm	Instech	FTP-20-30
Soluciones y tampones
La solución salina equilibrada de Hanks	Corning	21-023-CV
Solución salina tamponada con fosfato sin calcio ni magnesio	Corning	21-040-CV
Isoflurano	Halocarburos	12164-002-25