Generación de un modelo de asa de colon proximal en ratón: un procedimiento quirúrgico para generar asa de colon proximal y medir la permeabilidad intestinal mediante la detección de marcadores fluorescentes en suero después de la inyección intraluminal

Resumen

Fuente: Boerner, K. et al. Evaluación funcional de la permeabilidad intestinal y la migración transepitelial de neutrófilos en ratones utilizando un modelo de bucle intestinal estandarizado. J. Vis. Exp. (2021).

En este video, describimos un procedimiento quirúrgico para generar un bucle de colon proximal de ratón o un segmento pcLoop seguido de una inyección intraluminal de marcadores fluorescentes en el segmento para estudiar la permeabilidad epitelial intestinal.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Generación del bucle de colon proximal (pcLoop)

1. Preparación de la piel: Frote el pelaje de la línea media abdominal con hisopos con alcohol o una esponja de gasa empapada con etanol al 70%. No moje un área amplia de pelaje con alcohol para prevenir la hipotermia.
2. Con unas tijeras, realice una laparotomía de línea media. Realice una incisión vertical en el centro del abdomen (de unos 2 cm de longitud) y exponga el peritoneo. Tenga cuidado de no lesionar los órganos intraabdominales.
3. Coloque una gasa de algodón húmeda precortada sobre la cavidad intraabdominal expuesta.
4. Utilice bastoncillos de algodón húmedos para movilizar y exteriorizar el ciego. Coloque con cuidado el ciego sobre la gasa de algodón húmeda.
   nota: El ciego se localiza en el cuadrante caudal izquierdo de la cavidad abdominal en la mayoría de los ratones, independientemente del sexo del animal.
5. Con bastoncillos de algodón húmedos, exteriorice todo el íleon y colóquelo encima de una gasa de algodón húmeda. Identificar el colon proximal y el riego sanguíneo localizado en el mesocolon. Movilizar el colon proximal y mediante el uso de pinzas de punta fina crear la primera ligadura en un área libre de vasos en el mesocolon a unos 0,5 cm distal del ciego (Figura 1B).
6. Mida 2 cm desde la primera ligadura y cree una segunda ligadura en un área libre de riego sanguíneo en el mesocolon (Figura 1C).
7. Con unas tijeras finas, corte cuidadosamente al lado de cada ligadura para aislar un pcLoop.
   nota: Con unas tijeras finas cortadas cuidadosamente al lado de cada ligadura para aislar el asa ileal de 4 cm, manteniendo intacto el suministro de sangre y la membrana mesentérica, es importante cortar ambos extremos para aislar un pcLoop que se limpia suavemente de contenido luminal. Corta con cuidado el tejido colónico y el mesocolon para evitar que los vasos pequeños sangren hacia la luz intestinal. Si es necesario, use cauterio térmico para limitar el sangrado en el sitio de la incisión.
8. Enjuague suavemente el pcLoop con HBSS tibio para eliminar las heces utilizando un tubo de alimentación amarillo flexible conectado a una jeringa de 10 ml (Prepare una jeringa de 10 ml llena de HBSS tibio y conéctela a un tubo de alimentación amarillo. Esta jeringa se utilizará para hidratar los tejidos expuestos durante la cirugía).
9. Lije los dos extremos cortados del pcLoop enjuagado con sutura de seda.
10. Utilice una jeringa de 1 mL con aguja de 30G para inyectar lentamente 200 μL de reactivo como FITC-dextrans (1 mg / mL en HBSS). Mantenga la solución de FITC-dextrano no utilizada protegida de la luz para preparar la curva estándar después de la recolección del suero). El pcLoop se inflará provocando una distensión moderada de la mucosa (Figura 1D).
    nota: Inyecte el reactivo en el lumen pcLoop en el lado opuesto de la arteria mesentérica. Asegure la consistencia entre los animales y cree un pcLoop de 2 cm de largo para garantizar una distensión uniforme de la mucosa.
11. Utilice bastoncillos de algodón húmedos para volver a colocar suavemente el pcLoop ligado, el íleon y el ciego en la cavidad abdominal.
12. Utilice un portaagujas, pinzas anatómicas y suturas de seda 3.0 no absorbibles con aguja de corte inverso para cerrar la pared abdominal.
13. Coloque al animal en una cámara de anestesia con temperatura regulada durante el período de incubación.

Resultados

Figura 1: Modelo de asa de colon proximal. (A) Resumen esquemático del modelo pcLoop. La laparotomía mediana se realiza en ratones bajo anestesia colocados en una tabla de cirugía con temperatura controlada. (B) Exteriorización del ciego (*), colon proximal, mesocolon e íleon. Se identifican dos sitios adecuados para la ligadura (1,2). (C) La primera...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Equipamiento y material
Hisopos con alcohol BD	Bd	326895
BD 1ml Jeringa de Tuberculina Sin Aguja	Bd	309659
Aguja BD PrecisionGlide, 25G x 5/8"	Bd	305122
Aguja BD PrecisionGlide, 30G x 1/2"	Bd	305106
Aplicador de punta de algodón (bastoncillo de algodón), 6", estéril	PescadorCientífico	25806 2WC
Esponjas de gasa rellenas de algodón Dynarex, no estériles, 2" x 2"	Medex	3249-1
Vaporizador de anestesia EZ-7000 (Sistema Clásico, incluyendo unidades de calentamiento)	Sistemas E-Z	EZ-7000
Kimwipes, pequeñas (toallitas de tejido)	PescadorCientífico	06-666
Tijeras finas Moria	FST	14370-22
Puralube Vet Pomada, Lubricante Ocular Estéril	Dechra	12920060
Pinzas de anillo (pinzas de tejido romo)	FST	11103-09
Roboz Surgical 4-0 Seda Negro Trenzado, 100 YARDAS	PescadorCientífico	NC9452680
Pinza Semken (anatómica fórceps)	FST	Artículo 1108-13
Sofsilk Sutura Negra Recubierta No Absorbible Seda Trenzada Tamaño 3-0, 18", Aguja 19mm de longitud 3/8 círculo Corte inverso	HenrySchein	SS694
Pinzas finas para estudiantes, en ángulo	FST	91110-10
Jeringa de 10 ml PP/PE sin aguja	Millipore Sigma	Z248029
Reactivos
Isoflurano	Halocarburos	12164-002-25
Isotiocianato de fluoresceína-dextrano, peso molecular medio 4.000	sigma	60842-46-8