Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
>1. Aislamiento muscular EDL y digestión de colagenasa
- Rocíe todo el equipo con etanol al 70% para evitar la contaminación.
- Sacrificar el ratón de acuerdo con las normas nacionales para la experimentación animal.
- Rocíe las extremidades traseras del ratón con etanol al 70%. Utilice tijeras curvas finas endurecidas (filo de 24 mm) y pinzas finas (Dumont 7, curvas o rectas) para quitar la piel y exponer los músculos subyacentes. Evite cualquier contacto de los músculos subyacentes con el pelaje (aumenta el riesgo de contaminación).
- Retire la fascia circundante con pinzas curvas finas sin dañar los músculos subyacentes (Figura 1A). Cierre las pinzas para evitar que se agachen.
- Use pinzas curvas para exponer los tendones distales del TA (tibial anterior) y el músculo EDL. Para retirar el TA, agarre el tendón TA distal con pinzas y córtelo con unas tijeras de resorte Vannas finas (filo de 5 mm, diámetro de punta de 0,35 mm). Mientras sostiene el TA en el tendón, tire de él hacia la rodilla y corte el músculo cerca de la rodilla (Figura 1B), el músculo EDL ahora está expuesto><.
nota: Asegúrese de que solo se agarre el tendón TA en este paso, de lo contrario, el EDL subyacente podría dañarse. Al cortar el músculo TA, asegúrese de que los tendones de la rodilla se puedan ver fácilmente después.
- Levante el tendón EDL distal con pinzas curvas finas y corte con tijeras de resorte Vannas finas (Figura 1C). Exponga el tendón EDL proximal tirando con cuidado del EDL hacia la rodilla. Corta el tendón proximal con unas tijeras de resorte finas Vannas. Transfiera el músculo EDL a la solución de digestión de colagenasa precalentada a 37 °C de 2,5 mL, en el tubo de reacción de 15 mL. La solución de colagenasa se prepara de acuerdo con este procedimiento:
- Prepare la solución de digestión de la colagenasa disolviendo la colagenasa tipo 1 al 0,2% (p/v) (de Clostridium histolyticum) en DMEM (medio de Eagle modificado de Dulbecco con 4,5 g/L de glucosa y piruvato de sodio), filtre a través de un filtro de 0,22 μm. (Figura 1D).
nota: Realice una pequeña incisión en el tejido conectivo externo de la rodilla para exponer completamente el tendón EDL proximal. Asegúrate de agarrar solo los tendones y de no estirar demasiado el EDL.
- Repita los pasos 1.3. a 1.6 con la segunda EDL. Agregue ambos músculos EDL al mismo tubo de reacción de 15 mL lleno con 2.5 mL de solución de digestión de colagenasa.
- Incubar los músculos EDL en el tubo de reacción a 37°C en un baño de agua circulante.
nota: El tiempo de incubación depende de varios factores, como la actividad de la colagenasa, la edad del ratón y la cantidad de tejido fibrótico. El tiempo de incubación típico para los músculos EDL de ratones adultos (2-6 meses de edad) es de 1-1,5 h y para ratones envejecidos (18 meses de edad) de 1,5-2 h.
- Para evitar la digestión excesiva de los músculos, revise los músculos durante el tiempo de digestión. Detenga la digestión cuando los músculos se aflojen y las miofibras individuales sean visibles (Figura 1E). Transfiera los músculos con cuidado con la pipeta de gran diámetro al primer pocillo de la placa precalentada de 12 pocillos que contiene medio de aislamiento de miofibras (Figura 1G), que se prepara de la siguiente manera:
- Complemente DMEM (medio de águila modificado de Dulbecco con 4,5 g/L de glucosa y piruvato de sodio) con 20% de FBS (suero fetal bovino), filtro a través de un filtro de 0,22 μm. Agregue medio a las placas de aislamiento prerrevestidas (placa de 12 pocillos, 2-4 mL de medio de aislamiento por pocillo) aproximadamente 30 min antes del aislamiento y equilibre en una incubadora humidificada a 37 °C con 5% de CO2.
2. Disociación de miofibras
- Para los siguientes pasos, utilice un microscopio binocular estereoscópico, preferiblemente equipado con una placa calefactora (37 °C). Utilice la pipeta de gran diámetro para enjuagar los músculos con un medio de aislamiento tibio hasta que se liberen las miofibras individuales. Disocie los músculos con la pipeta de gran diámetro hasta que el número deseado de miofibras flote libremente en la solución.
nota: Evite la trituración excesiva para reducir el riesgo de miofibras dañadas. Se recomienda encarecidamente el uso de una placa calefactora para la disociación de miofibras, ya que la temperatura desciende durante el proceso de aislamiento, lo que provocará la muerte de las miofibras.
