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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Agujas de vidrio estériles
- Encienda el extractor de pipetas de aguja.
- Ajuste la perilla del calentador hasta que la pantalla muestre 12.6.
- Abra la puerta y pase manualmente el tubo capilar de 5 μL a través de la abrazadera superior y el filamento del calentador hasta que la mitad del tubo se extienda por debajo del filamento (Figura 1A).
- Confirme que el tubo capilar esté en la ranura en "V" de la abrazadera superior. Apriete la abrazadera superior.
- Con la abrazadera inferior abierta, ajuste manualmente el deslizamiento vertical hasta que la abrazadera inferior alcance su límite superior. Confirme que el tubo esté en la ranura en "V" de la abrazadera inferior. Apriete la abrazadera inferior.
- Cierre la puerta y confirme que la luz de "Listo" esté encendida. Presione el botón de inicio para iniciar el calentador y la secuencia de tracción (Figura 1B).
- Asegúrese de que el calentador se apague automáticamente después de que el calor y la gravedad separen el tubo capilar (Figura 1C) y la corredera se mueva hacia abajo.
- Abre la puerta. Mientras sujeta la parte superior del tubo capilar, afloje la abrazadera superior. Retire el tubo capilar superior y déjelo a un lado.
- Sujete el tubo capilar en la corredera inferior y afloje la abrazadera inferior. Retire el tubo capilar inferior y déjelo a un lado.
- Utilice un biselador de microelectrodos con una placa abrasiva de esmerilado abrasivo de alúmina de 0,05 μm para biselar el tubo capilar estirado para crear las agujas de inyección.
- Pipetee suficiente agua en la placa de molienda para cubrir la superficie (Figura 1D).
- Encienda la biseladora para que comience a girar a 60 rpm. Coloque el tubo capilar tirado en la abrazadera de pipeta en la ranura en "V". Apriete la pinza y ajuste el ángulo de la pinza de pipeta a 30°.
- Ajuste la punta del borde puntiagudo del tubo capilar aproximadamente a dos tercios de distancia del centro de rotación de la placa de molienda.
- Baje el tubo capilar sujetado ajustando la perilla de control gruesa en la parte superior del manipulador. Continúe bajando el tubo capilar hasta que la punta del tubo capilar se extienda por debajo de la superficie del agua y entre en contacto con la superficie abrasiva de la placa de molienda.
- Controle el progreso del biselado con el microscopio conectado al biselador. Después de 5 minutos, ajuste el control fino para levantar la aguja de vidrio de la placa de molienda.
- Retire la aguja de vidrio y colóquela con un aumento de 10x para verificar la punta del tubo capilar (Figura 1E, F).
- Para asegurarse de que no haya obstrucciones, inserte la aguja de vidrio en un soporte de pipeta en una jeringa y empuje el aire en un tubo de 1 ml de etanol al 99%. Si se forman burbujas de aire en la punta de la aguja, la aguja no tiene obstrucciones y se puede utilizar para la microinyección. Este proceso también garantiza la esterilidad de las agujas de vidrio.
- Un tubo capilar puede contener hasta 5 μL de líquido. Marque el tubo capilar en 10 secciones para calcular las distancias en la aguja para marcar volúmenes de 0,5 μL. Marque una escala con esa distancia que contenga 0,5 μL para la preparación futura. Para una aguja de 5 μL, las distancias de 0,7 mm equivalen a 0,5 μL (Figura 1G).
>2. Inyección intravítrea de ratón
- Realice todos los procedimientos de esta sección bajo condiciones de Bioseguridad Nivel 2.
- Prepare el sitio del procedimiento colocando almohadillas médicas en la mesa de operaciones.
- Encienda el microinyector y abra la válvula de gas en el tanque de aire comprimido conectado al microinyector. Ajuste el regulador del tanque hasta que el suministro de gas sea de aproximadamente 60 psi.
- En el microinyector, presione Mode hasta que la pantalla muestre Balance. Presione Balance y coloque el mouse de la computadora en la mesa de operaciones. Conecte el soporte de pipeta de acero inoxidable al tubo conectado a 'Fill/Output' del inyector. Este tubo siempre está conectado al inyector.
- Inserte la aguja capilar en el otro extremo del soporte de pipeta atornillando firmemente el conector del soporte de pipeta alrededor de la aguja.
- Encienda el microscopio oftálmico y encienda su luz a una intensidad del 50%. Ajuste el microscopio sobre el sitio del procedimiento en la mesa de operaciones y ajuste el microscopio al enfoque deseado.
- Antes de comenzar el procedimiento, confirme que el ratón está adecuadamente anestesiado probando el reflejo de retirada del pedal. Asegúrese de seguir el protocolo de anestesia aprobado por la IACUC.
- Coloque el ratón anestesiado en las almohadillas médicas con la nariz apuntando hacia la derecha e inclinada sobre el lado izquierdo.
- Mire el ojo derecho del ratón a través del microscopio oftálmico y abra los párpados abriendo las pinzas de una pinza de acción inversa a cada lado del ojo para exponer el lugar de la inyección (Figura 2C).
- Llene la aguja capilar con la solución bacteriana de Bacillus cereus (ATCC 14579) (dilución de 200 UFC/μL) haciendo clic con el botón izquierdo del ratón en la alfombrilla del ratón conectada al microinyector (Figura 2D).
- Asegure la cabeza del animal con la mano izquierda y coloque la punta de la aguja en el limbo del ojo. Con la aguja en la posición de bisel hacia arriba y en un ángulo de 45°, perfore el ojo del ratón, pero asegúrese de que solo se inserte la punta afilada de la aguja (~0,5 mm) al inyectar.
- Una vez insertada la punta de la aguja, mueva la mano izquierda de la cabeza del ratón a la alfombrilla y haga clic con el botón derecho del ratón en la alfombrilla para inyectar 0,5 μL de la dilución de B. cereus preparada en el caldo Brain Heart Infusion (BHI). Para evitar fugas, deje la punta de la aguja dentro del ojo del ratón durante 2-3 segundos antes de retirarla (Figura 2E).
- Suelte las pinzas y coloque al ratón en una jaula que esté colocada sobre una almohadilla térmica. Monitoree a estos ratones hasta que se hayan recuperado de la anestesia (Figura 2F).
- Una vez que los ratones se hayan recuperado de la anestesia, devuelva la jaula a su estante adecuado. Si los ratones van a ser sometidos a un análisis de la función de la retina mediante electrorretinografía, las jaulas deben devolverse a una habitación oscura para una adaptación adecuada a la oscuridad.
