Ensayo de cuantificación de infecciones bacterianas: un método para cuantificar la carga bacteriana intraocular en un modelo murino de endoftalmitis bacteriana

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Preparación del tubo de recolección

1. Coloque perlas de vidrio estériles de 1 mm en tubos con tapón de rosca de 1,5 ml.
2. Esterilice estos tubos en un autoclave en un entorno seco. Deje que los tubos se enfríen a temperatura ambiente antes de usarlos.
3. Agregue 10 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) estéril 1x a un tubo de centrífuga estéril de 15 mL.
4. Agregue 1 tableta de cóctel de inhibidor de proteasa en el tubo. Mezclar por vórtice.
5. Pipetear 400 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x que contiene inhibidor de la proteasa en cada tubo de cosecha esterilizado en autoclave. Etiquete los tubos y colóquelos en hielo. (Figura 1A).

2. Cosechando los ojos

1. Realice todos los procedimientos de esta sección bajo condiciones de Bioseguridad Nivel 2.
2. Eutanasia del ratón por inhalación de CO₂. Utilice un método secundario para confirmar la eutanasia.
3. Sostenga la cabeza del ratón sacrificado y abra las pinzas de punta fina a cada lado del ojo infectado. Empuje hacia abajo hacia la cabeza para apoyar el ojo. Una vez que las pinzas estén detrás del globo del ojo, apriételas. Tire de las pinzas lejos de la cabeza para separar el globo ocular (Figura 1B).
4. Coloque inmediatamente el globo ocular en un tubo de recolección etiquetado. Coloque los tubos en hielo durante no más de 60 minutos (Figura 1C).

3. Recuento bacteriano intraocular

1. Realice todos los procedimientos de esta sección bajo condiciones de Bioseguridad Nivel 2.
2. Confirme que todos los tubos de recolección estén bien cerrados y equilibrados mientras estén en el homogeneizador de tejidos (Figura 2A). Encienda el homogeneizador de tejidos durante 1 min para homogeneizar las muestras. Espere 30 segundos y luego enciéndalo durante un minuto más. Coloque los tubos sobre hielo (Figura 2B, C).
3. Diluir en serie cada muestra 10 veces transfiriendo secuencialmente 20 μL del homogeneizado a 180 μL de PBS estéril 1x. Diluir hasta alcanzar un factor de ^10-7 (Figura 2D).
4. Etiquete cada fila de un plato BHI cuadrado y tibio con los factores de dilución adecuados. Transfiera 10 μL de cada dilución en una fila a la placa superior de BHI que esté inclinada aproximadamente 45°. Deje correr la muestra hasta que casi llegue al fondo de la placa, luego coloque la placa plana (Figura 2E).
5. Cuando la muestra se absorba en el agar BHI, transfiera la placa a una incubadora a 37 °C. Las colonias deben comenzar a ser visibles 8 h después de ser colocadas en la incubadora.
6. Retire la placa de la incubadora antes de que el crecimiento de las colonias de B. cereus interfiera con la identificación de las colonias individuales (Figura 2F).
7. Para una representación precisa de la concentración en la muestra, cuente la fila que tiene entre 10 y 100 colonias. Por ejemplo, una fila con la fracción de dilución de ^10-4 que tiene 45 colonias tendrá una concentración de 4,5 x 10⁵ UFC/mL.
8. Para calcular el número total de bacterias por ojo, multiplique la concentración por 0,4, que representa el volumen de mililitros de 1x PBS utilizado para homogeneizar el ojo. Por ejemplo, la concentración de 4,5 x 10⁵ UFC/mL se traduciría en 1,8 x 10⁵ UFC B. cereus por ojo.

Figura 1: Extracción de ojos de ratón infectados. Después de la infección, después del punto de tiempo deseado, se extraen ojos de ratón infectados utilizando pinzas estériles. (A) PBS que contiene perlas de vidrio estériles. (B) Extracción del ojo infectado. (C) Tubo de recolección que contiene un ojo de ratón.

Figura 2: Procesamiento del ojo extraído para el recuento bacteriano intraocular. (A) Tubo de extracción con el ojo infectado sujetado firmemente a un homogeneizador de tejido. (B) Los ojos infectados se homogeneizaron dos veces durante 1 minuto cada uno. Seguimiento de la dilución (D) de los homogeneizados oculares (C) y posterior colocación de placas (E) para la cuantificación bacteriana. (E) Colonia representativa de Bacillus cereus después de la dilución de la pista.