Perfusión pulmonar ex vivo: una técnica para la investigación pulmonar en un modelo de conejo

Resumen

Fuente: Pacheco-Baltazar, A., et al., Sistema de Perfusión Pulmonar Aislado en el Modelo de Conejo. J. Vis. Exp. (2021).

Este video muestra una técnica ex vivo para la perfusión pulmonar aislada. Se trata de una herramienta para la investigación pulmonar que ayudará a los estudios de diversos mecanismos fisiológicos y patológicos implicados en los procedimientos de trasplante pulmonar.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Canulación:

1. Coloque los pulmones del conejo recién aislado junto con el corazón sobre una gasa estéril en una placa de Petri.
2. Para prevenir la atelectasia, ventile los pulmones con ventilación de presión positiva con presión positiva al final de la espiración (PEEP) establecida en 2 cmH₂O.
3. Extirpa los ventrículos cortándolos del corazón a nivel del surco auriculoventricular.
4. Después de abrir los dos ventrículos, introducir la cánula de la arteria pulmonar OD de 4,6 mm para el conejo con una cesta a través de la arteria pulmonar e introducir la cánula de la aurícula izquierda OD 5,9 mm para el conejo con la cesta a través de la válvula mitral en la aurícula izquierda.
5. Use una sutura de seda 4-0 en la arteria pulmonar y la aurícula izquierda para fijar las cánulas. Incluir los tejidos circundantes en las ligaduras de la arteria pulmonar y la aurícula izquierda para evitar la distensión de estas estructuras.
6. Inyecte 250 mL de solución salina isotónica a través de las cánulas arteriales para eliminar la sangre restante del lecho vascular.

2. Técnica de perfusión:

1. arreglo:
   1. Coloque los pulmones aislados con cuidado en la cámara pulmonar.
   2. Conecte la tráquea al transductor en la tapa de la cámara.
   3. Conecte los vasos canulados al sistema de perfusión.
   4. Cierre la cámara y asegúrela con la cerradura giratoria.
      nota: El circuito de perfusión de recirculación consta de un depósito venoso abierto, una bomba peristáltica, un intercambiador de calor y una trampa de burbujas.
   5. En este punto, coloque la tapa de la cámara y cambie una llave de paso para cambiar de ventilación de presión positiva a negativa. Para verificar la ventilación con presión negativa de los pulmones y el cierre hermético de la cámara, inspeccione la excursión respiratoria del pulmón y la presión de la cámara en el manómetro.
   6. Perfundir los pulmones con 200 mL de perfusión artificial libre de sangre (un tampón de bicarbonato de Krebs-Ringer que contiene 2,5% de albúmina bovina).
   7. Inicie el flujo de perfusión a 3 mL/min/kg, luego aumente lentamente el flujo durante un período de 5 minutos a 5 mL/min/kg. Alcance un flujo de 8 mL/min/kg durante los siguientes 5 minutos y luego, después de otro período de 5 minutos, alcance un flujo máximo de 10 mL/min/kg. Tenga cuidado de evitar que el aire entre en el circuito.
      nota: Mantener el pH y la temperatura del perfusionado dentro de rangos fisiológicos (pH 7,4-7,5; temperatura, 37 °C-38 °C). Para ajustar el pH, agregue NaHCO₃ (1N) o aumente el flujo de dióxido de carbono. Alternativamente, use HCl (0.1N) para acidificar.
2. Parámetros:
   1. Compruebe si los parámetros predeterminados de perfusión y ventilación están ajustados según sea necesario.
   2. Ventilar los pulmones con aire humidificado a una frecuencia de 30 lpm, un volumen corriente de 10 mL/kg y una presión final de espiración (Pe) de 2 cmH₂O.
      nota: La presión arterial pulmonar (0-20 mmHg) corresponde a la altura del nivel del líquido en el oxigenador o reservorio en centímetros por encima del tronco pulmonar, mientras que la presión venosa pulmonar corresponde a la altura de la cámara de equilibrio de presión por encima de la aurícula izquierda. Ambos valores se pueden modificar. Tenga en cuenta que la presión de la aurícula izquierda también es de 0-20 mmHg.
3. Cumplimiento de las condiciones de la zona 3:
   1. Utilice los dos catéteres conectados a los puertos laterales de las cánulas asegurados en la arteria pulmonar, la aurícula izquierda y los transductores de presión para medir las presiones arterial (Pa) y venosa (Pv).
   2. Ajuste las presiones basales a nivel del hilio pulmonar (referencia cero).
   3. Realice los experimentos en condiciones de ventilación de zona 3. Para lograr esto, espere 10-15 minutos para obtener un equilibrio caracterizado por un estado isogravimétrico.
   4. Asegúrese de que la presión venosa sea más alta que la presión alveolar (Palv) y que la presión arterial permanezca más alta que ambas (Pa > Pv > Palv) para que ocurran las condiciones de la Zona 3.
   5. Asegúrese de que el peso de los pulmones permanezca constante y que las presiones arterial y de la aurícula izquierda sean estables para lograr las condiciones de la zona 3 para abrir un número máximo de vasos pulmonares y mantener el contenido del lecho microvascular durante el experimento.
      nota: La medición de Kfc como indicador de edema pulmonar no tiene variación entre un sistema de perfusión manual y uno automático.
4. Control electrónico y procesamiento de señales: Asegurar que el flujo respiratorio, los cambios de peso, la presión microvascular, el volumen corriente, la resistencia vascular, entre otros, se registren en una unidad electrónica central múltiple que integra las señales provenientes de los transductores y las muestra en el sistema de evaluación.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubo Tygon E-Lab de 2 pasos, 3,17 mm de diámetro interior, 12/paquete, negro/blanco	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-1864
Adaptador para ventilación de presión positiva en IPL-4	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4312
Adaptador para ventilación de presión positiva en IPL-4	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4312
Suministro alternativo de gas sin presión para IPL-4: Para suministrar a la tráquea una mezcla de gases diferente del aire ambiental durante la ventilación negativa	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4309
Unidad base para el pulmón aislado perfundido de conejo a cerdo fetal	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4138
Suero bovino A2: D41albúmina liofilizado en polvo	sigma	3912	500 g
Cloruro de calcio, CaCl2·2H2O.	JT Panadero	10035-04-8
Viales criogénicos	Corning	430659	2 mL
D-glucosa, C6H12O6.	sigma	G5767
Transductor diferencial de baja presión DLP2.5, rango +- 2,5 cmH2O, conector HSE	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-3882
Transductor de presión diferencial MPX, rango +- 100 cmH2O, conector HSE	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-0064
Tubos Eppendorf
Etanol absoluto de grado HPLC	Caledón
Tubos de halcón			14 mL
Bomba peristáltica Harvard P-230 (completa con caja de control y accionamiento de motor P-230)	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	70-7001
Neumotacómetro lineal calentado Rango de caudal de 0 a 10 L/min	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	59-9349
Controlador de calentador para neumotacómetro individual 230 VCA, 50 Hz	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	59-9703
heparina	Pisa		5000 UI
Columna de HPLC (C18 100A 5U)	Alltech	98121213	150 mm x 4,6 mm
Filtro de jeringa hidrófilo	Millex	SLLGR04NL	4 milímetros
Sistema central IPL-4 para pulmón aislado de conejo a fetal de cerdo, 230	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4296
Sistema central IPL-4 para pulmón aislado de conejo a cerdo fetal, 230 V	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4296
Depósito de vidrio encamisado para solución tampón, con frita y tubería, 6,0 L	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-0322
Termostato Lauda, tipo E-103, 230 V/50 Hz, volumen de baño de 3 L, rango de temperatura de 20 a 150 °C	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-0125
Cánula de aurícula izquierda para conejo con cesta, diámetro exterior 5,9 mm	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4162
Transductor de presión arterial de rango bajo P75 para módulo PLUGSYS	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-0020
Sulfato de magnesio heptahidratado, MgSO4·7H2O	JT Panadero	10034-99-8
Tubo de microcentrífuga	Corning	430909
Opción de control de ventilación de presión negativa con regulador de presión para IPL-4	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4298
Nuevos conejos de Zelanda
PISABENTAL (Pentobarbital sódico)	Pisa	Q-7833-215
Caja PLUGSYS, tipo 603* 7	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-0045
Módulo de contador de tiempo PLUGSYS TCM	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-1750
Módulo amplificador de transductor PLUGSYS (TAM-A)	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-0065
Módulo amplificador de transductor PLUGSYS (TAM-D)	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-1793
Módulo de control de ventilación PLUGSYS VCM-4R con regulador de presión	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-1755
Cloruro de potasio, KCl.	JT Panadero	3040-01
Fosfato de dihidrógeno de potasio, KH2PO4	JT Panadero	7778-77-0
Cánula de arteria pulmonar para conejo con cesta, diámetro exterior 4,6 mm	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4161
Servocontrolador de perfusión (SCP	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-2806
Tubo de microcentrífuga con tapa a presión	Coprotagonista	3620	1,7 mL
Bicarbonato de sodio, NaHCO3	sigma	S6014
Cloruro de sodio, NaCl.	sigma	S9888
Guantes quirúrgicos n.º 7 1/2
Guantes quirúrgicos n.º 8
Tubos Taygon	Masterflex
Cánula traqueal para conejo, OD 5.0 mm	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4163