Preparación de un modelo de conejo consciente para video-EEG-ECG-oximetría-capnografía simultánea para intervenciones experimentales: un procedimiento para implantar electrodos de EEE-ECG y conectar sondas respiratorias en un modelo de conejo

Resumen

Fuente: Bosinski, C. et al., Monitoreo multisistémico para la identificación de convulsiones, arritmias y apnea en conejos conscientes restringidos. J. Vis. Exp. (2021).

Este video muestra el procedimiento para implantar electrodos de EEG-ECG y conectar sondas respiratorias en un modelo de conejo para adquirir y analizar registros de sus señales biológicas.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Implantación de electrodos EEG-ECG y colocación de monitores respiratorios

1. Retire un conejo de la jaula de transporte y colóquelo en el regazo de un investigador sentado.
2. Sostén el conejo verticalmente y mantenlo cerca del cuerpo del investigador.
3. Baje el conejo a una posición supina, con la cabeza del conejo a la altura de las rodillas del investigador y la cabeza del conejo más baja que el resto de su cuerpo.
   nota: Esta maniobra relaja al animal y minimiza la probabilidad de que intente moverse o escapar mientras coloca los electrodos.
4. Ahora que el conejo está asegurado en posición supina, pídele a un segundo investigador que extienda el pelaje hasta que la piel pueda ser identificada y aislada del tejido subyacente.
5. Inserte electrodos doblados a 35° subdérmicamente en cada axila (Figura 1A).
   nota: Los electrodos deben empujarse a través de ellos para que queden firmemente enganchados a la piel, pero no penetren en estructuras más profundas. El hecho de que el electrodo entre y luego salga de la piel (de principio a fin) reduce la posibilidad de que los cables se desprendan al colocar al conejo en el sujetador o si se mueve durante el experimento (Figura 1B). Todos los electrodos se esterilizan con etanol al 70% antes de su colocación.
6. Coloque los cables en el tórax posterior a las extremidades anteriores derecha e izquierda y en el abdomen anterior a la extremidad posterior izquierda. Coloque un electrodo de clavija de tierra anterior a la extremidad posterior derecha en el abdomen (Figura 2A).
7. Una vez que todos los cables de ECG estén colocados correctamente, regrese al conejo a una posición prona, con los cables subiendo por un lado del abdomen del conejo, y transfiera al conejo a un sujetador de tamaño adecuado (por ejemplo, 6" x 18" x 6"). Al colocar al conejo en el sujetador, tire del cable suelto hacia arriba para minimizar que el conejo saque los electrodos con las patas. Pegue los cables con cinta adhesiva al costado del sujetador para que no queden atrapados debajo del conejo durante el experimento (Figura 2B).
8. Asegure al conejo en el sujetador bajando la restricción alrededor del cuello y bloqueándola en su lugar. Además, mueva las extremidades traseras hacia arriba por debajo del animal y asegure el sistema de retención trasero.
   nota: Uno debe poder colocar 1-2 dedos dentro del espacio debajo del cuello para asegurarse de que no quede demasiado apretado. Especialmente durante los experimentos en los que puede haber movimiento motor, es importante ajustar el sistema de sujeción para minimizar el movimiento, las posibles lesiones de la columna vertebral, la dislocación de las extremidades y la capacidad de expulsar el sistema de sujeción trasero (Figura 2B). Los conejos se han mantenido en el retenedor durante ~ 5 h sin ningún problema relacionado con un mayor movimiento o signos de deshidratación.
   1. Para conejos pequeños (por ejemplo, menos de 2 meses) coloque una almohadilla de goma debajo del animal para levantar al conejo, lo que evita que el conejo apoye el cuello en la parte inferior del reposacabezas (Figura 2C)
      nota: Una caída repentina de la frecuencia respiratoria y cardíaca puede ser secundaria al pinzamiento del cuello. Si esto ocurre, afloje el sujetador de cuello y levante la cabeza del conejo para aliviar cualquier compresión del cuello.
   2. Cuando el sistema de sujeción trasero no traza de cerca la espalda/columna vertebral del conejo, coloque un espaciador de PVC para evitar cualquier movimiento que pueda causar lesiones >nota: Por ejemplo, la tubería de PVC de ~ 14 cm de largo x 4" de diámetro interior, con el 25-33% inferior eliminado, se puede colocar sobre el conejo con espuma para proporcionar una restricción adecuada (Figura 2C).
9. Ahora que el conejo está bien colocado en el sujetador, inserte los electrodos subdérmicos de alfiler recto de 7-13 mm en el cuero cabelludo (Figura 1A). Usando un enfoque de entrada en un ángulo de 45°, pase los cables entre las orejas y ate los cables sin apretar al sujetador detrás de la cabeza para mantener la colocación del cable. Coloque 5 derivaciones de EEG en las siguientes posiciones: anterior derecha, anterior izquierda, occipital derecha, occipital izquierda y una derivación central de referencia (Cz) en el punto entre las otras 4 derivaciones (Figura 2D)
   nota: Los electrodos se colocan correctamente cuando se colocan en el tejido subcutáneo contra el cráneo. Esta colocación minimiza los artefactos de la nariz, las orejas y otros músculos circundantes. Es inevitable algún artefacto del movimiento rítmico de la nariz. Los electrodos electroencefalograma anteriores deben colocarse medial a los ojos del conejo y apuntar hacia atrás. Los cables occipitales deben colocarse antes de las orejas y apuntarán en la dirección medial. Cz se coloca en el centro de la parte superior de la cabeza en un punto que está entre los 4 electrodos (a medio camino entre Lambda y Bregma, a lo largo de la línea de sutura). La clavija del electrodo Cz apunta hacia atrás.
   1. Pasa los alambres del electroencefalograma entre las orejas para evitar que el conejo intente morderlos.
10. Coloque el pletismógrafo del oxímetro de pulso en la oreja del conejo sobre la vena marginal del oído.
    nota: Puede ser necesario afeitar el exceso de vello de la oreja para mejorar la señal o usar una gasa para mantener el sensor en su lugar.
    1. Asegúrese de que la frecuencia cardíaca en la pletismografía se correlacione con la frecuencia cardíaca del ECG y que se muestre la saturación de oxígeno (Figura 3C).
11. Coloque suavemente la mascarilla con tubo de capnografía sobre la boca y la nariz del conejo (Figura 2H). Asegure la mascarilla con una cuerda enrollada alrededor de la mascarilla y fije ambos extremos de la cuerda al sujetador. Conecte el otro extremo del tubo de capnografía al monitor de signos vitales.
    nota: Es importante evitar que la cuerda quede sobre los ojos del conejo durante el experimento. Para hacer esto, pega la cuerda al centro del sujetador entre las orejas del conejo. Para mejorar la señal de capnografía, cree una válvula unidireccional con cinta adhesiva y una pieza delgada de nitrilo que permitirá que el oxígeno ingrese a la pieza T y dirigirá el CO2 exhalado al tubo de capnografía (Figura 2I).

2. Grabación de video-EEG-ECG

1. Realice el registro de video-EEG-ECG utilizando un software de EEG disponible en el mercado.
   nota: Las derivaciones biopotenciales y el video están bloqueados en el tiempo para correlacionar posteriormente las señales eléctricas y de video (por ejemplo, pico de EEG con una sacudida mioclónica).
2. Confirme una conectividad óptima, sin deriva de referencia, sin ruido eléctrico de 60 Hz y con una alta relación señal-ruido. Específicamente, asegúrese de que cada fase de la forma de onda cardíaca se pueda visualizar en el ECG y que las ondas delta, theta y alfa no se vean oscurecidas visualmente por el ruido de alta frecuencia en el EEG.
   1. Si todos los electrodos producen cantidades excesivas de ruido, ajuste el cable de referencia central. Si solo un electrodo es excesivamente ruidoso, empuje ese electrodo más profundamente en la piel o vuelva a colocarlo hasta que no quede metal expuesto.
3. Ajuste el video para que todos los conejos puedan ser vistos simultáneamente, lo que permite la correlación de la actividad motora con los hallazgos del EEG (Figura 3A).
   nota: El sistema admite registros simultáneos de EEG/ECG/oximetría/capnografía de hasta 7 conejos.
4. Inicie el registro de referencia de cada animal durante un mínimo de 10-20 minutos o hasta que la frecuencia cardíaca se estabilice a un estado tranquilo y relajado (200-250 lpm) y los conejos no muestren grandes movimientos durante al menos 5 minutos. Adquiera datos electrográficos de ancho de banda completo sin ningún filtro. Para visualizar mejor los datos, ajuste el filtro de baja frecuencia (=filtro de paso alto) a 1 Hz y el filtro de alta frecuencia (=filtro de paso bajo) a 59 Hz.
   nota: Otra señal de que el conejo está relajado es la aparición de los husos del sueño EEG (discutidos más adelante).
5. Agregue notas bloqueadas en tiempo real durante el experimento para indicar el momento de las intervenciones (p. ej., administración de fármacos) y eventos neurocardíacos (p. ej., pico de EEG, convulsiones motoras, latidos ectópicos y arritmias), y artefactos motores/investigadores><. nota: Debido a la frecuencia con la que el investigador necesita aplicar una intervención (por ejemplo, estimulación fótica, administración de fármacos), para minimizar el estrés de un investigador que entra y sale de la habitación y abre/cierra la puerta, el investigador permanece en el lado opuesto de la habitación durante todo el experimento. El investigador se sienta lo más lejos posible del animal y permanece quieto y silencioso para minimizar las posibles molestias a los animales.

Resultados

Figura 1: Imagen de EEG y electrodos de ECG. (A) Electrodos de ECG doblados y electrodos de EEG rectos. (B) Cómo enganchar el electrodo de ECG en el tejido subcutáneo del conejo, de modo que quede de paso a través. Abreviaturas (LL: Extremidad izquierda, RA: Brazo derecho, RL: Extremidad derecha, LA: Brazo izquierdo, RF: Frontal derecho, LF: Frontal izquierdo, Cz: Ce...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
ordenador	Dell	Optiplex 5040	Ordenador de adquisición
Electrodo de ECG	RhythmLink (en inglés)	RLSND116-2.5	Electrodos de clavija subdérmica de 13 mm y 35 grados doblados (0,4 mm de diámetro)
Electrodo de EEG	RhythmLink (en inglés)	RLSP513	Electrodos de clavija subdérmica recta de 13 mm (0,4 mm de diámetro) de 5
EEGLAB (2020)	Centro Swartz de Neurociencia Computacional	Acceso abierto	Puede realizar análisis espectrales de EEG
Adaptador de Ethernet a Ethernet	Linksys	USB3G16	Adaptador para conectar la cámara al ordenador
Acolchado de espuma	genérico	N/A	Reduce la presión aplicada al cuello de los conejos pequeños por el sujetador para evitar los efectos cardiorrespiratorios adversos de la compresión del cuello
MATLAB (R2019b, actualización 5)	Obras de matemáticas	N/A	Necesario para ejecutar EEGLAB
micrófono	Estéreo de Sony	ECM-D570P	Registro de las manifestaciones sonoras de las convulsiones
Cinta médica Micropore, Papel, Blanco	3M	1530-1	Se utiliza para asegurar cables y crear férulas para la oreja
Natus NeuroWorks	Natus	LC101-8	Adquisición y revisión de software
Estimulador fótico	hierba	PS22	Estimulador para controlar la frecuencia, el retardo, la duración, la intensidad de los pulsos de luz
Organizador / empaquetador de alambre de plástico	12Vwire.com	LM-12-100-BLK	Haz cables para reducir el ruido
PS 22 Estimulador Fótico	Instrumentos de hierba	BZA641035	Luz estroboscópica con frecuencia de flash, retardo e intensidad ajustables
Tubería de PVC	genérico	N/A	Evita que los conejos pequeños pateen sus patas traseras y causen lesiones en la columna
Protector de conejos	Plas-Labs	501-TC	Hay disponibles sujetadores de conejos de varios tamaños. 6" x 18" x 6" en este estudio.
Almohadilla de goma (refuerzo)	genérico	N/A	Cría conejos pequeños en el sujetador para evitar la compresión del cuello
Pinza para la oreja SpO2	NONIN	61000	PureSAT/SpO2
Adaptador de sensor SpO2	NONIN	Año 13931	XPOD PureSAT/SpO2
Webcol Preparación para Alcohol, Estéril, Grande, 2 Capas	Covidien	5110	Para preparar la vena del oído antes del cateterismo
LabChart Pro (2019, versión 8.1.16)	ADInstrumentos	N/A	Análisis de ECG
Amplificador cuántico	Natus	Año 13926	Amplificador / digitalizador
Amplificador Quantum HeadBox	Natus	22134	Caja de conexiones de 64 pines
Cámara PTZ SRG-X120 1080p con salida HDMI, IP y 3G-SDI	Sony	SRG-X120	Cámara Impela