Aislamiento de células IPE y RPE: una técnica para obtener células epiteliales pigmentarias oculares a partir de ojo de conejo

Resumen

Fuente: Bascuas, T., et al. Aislamiento, cultivo e ingeniería genética de células epiteliales de pigmento primario de mamíferos para terapia génica no viral. J. Vis. Exp. (2021).

En este video, mostramos un procedimiento para obtener células epiteliales pigmentarias oculares a partir de un modelo de conejo. Las células son útiles en el desarrollo de estrategias terapéuticas para las enfermedades degenerativas de la retina.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

Los conejos blancos de Nueva Zelanda fueron sacrificados mediante una sobredosis de Pentobarbital (150 mg/kg) diluido en NaCl al 0,9% inyectado intraperitoneal, y los ojos fueron enucleados inmediatamente después del sacrificio.

1. Antes de la preparación

1. Prepare el medio completo (DMEM/Ham F12 suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS), 80 U/mL de penicilina / 80 μg/mL de estreptomicina y 2,5 μg/mL de anfotericina B). Calentar el medio, 1x PBS y tripsina al 0,25% (si es necesario) en un baño de agua a 37 °C.
2. Coloque un paño estéril en la campana para preparar un lugar de trabajo aséptico. Introduzca todos los instrumentos y materiales estériles necesarios dentro de la campana.
   nota: Solo la enucleación de los ojos y la limpieza del tejido muscular y la piel restantes son los procedimientos que se realizan fuera de la capucha, el resto de los pasos deben realizarse dentro de la capucha.

2. Aislamiento de células de PE de conejo

1. Utilice tijeras curvas y pinzas Colibrí para enuclear los ojos después de la eutanasia del animal. Limpie el tejido muscular restante y la piel de los ojos con tijeras y pinzas (no estériles).
   nota: El tamaño de las tijeras y pinzas utilizadas para la enucleación y limpieza de los ojos depende de la especie (por ejemplo, para ratas y ratones los instrumentos van a ser más pequeños que los utilizados para cerdos y ganado) (ver Figura 1).
   1. Recoja los ojos en un tubo de 50 ml lleno de PBS no estéril y transfiera el tubo a la campana de flujo laminar. Desinfecte los ojos sumergiéndolos durante 2 minutos en una solución a base de yodo, luego transfiéralos a una placa de Petri llena de PBS estéril.
2. Apertura de la bombilla
   1. Coloque un ojo sobre una compresa de gasa estéril y manténgala firmemente cerca del nervio óptico. Abra el ojo con el bisturí #11 y las tijeras unos 2 mm por debajo del limbo. Retire el segmento anterior (córnea, cristalino e iris) y colóquelo en una placa de Petri. Deje el bulbo con el vítreo hasta que se aíslen las células del EPR.
3. Aislamiento de células IPE
   1. Retire la lente y, con pinzas finas, extraiga delicadamente el iris que contiene las células IPE. Coloque el iris en una placa de Petri, lávela con PBS estéril y déjela en PBS hasta que se preparen más iris. Retire el cuerpo ciliar del iris cortando con un bisturí # 10.
   2. Después de la preparación de 2 iris, incubar con 1 mL de tripsina al 0,25% a 37 °C durante 10 min; durante este tiempo, se pueden aislar las células del EPR (ver paso 2.4). Retire la tripsina y añada 1 ml de medio completo al iris y aísle las células rascando cuidadosamente con una pipeta Pasteur plana pulida al fuego. Vuelva a suspender las células con cuidado pipeteando y transfiera la suspensión celular a un tubo de 1,5 ml. Tome 10 μL de la suspensión celular y diluya 1:3 con azul de tripano para contar las células en la cámara de Neubauer.
   3. Si no se transfecta inmediatamente, siembre 200.000 células/pocillo en una placa de 24 pocillos (100.000 células/^cm2) en 1 mL de medio completo (10% FBS) (para la siembra ver Tabla 1). Coloque la placa en una incubadora y cultívela a 37 °C, 5% CO2.
      nota: Puede ser necesario juntar varios ojos para tener suficientes células para la siembra.
4. Aislamiento de células EPR
   1. Extraer el humor vítreo y la retina del segmento posterior con pinzas finas. Evite dañar el epitelio pigmentario de la retina.
   2. Coloque una gasa estéril en una placa de 12 pocillos y coloque la pera sobre la gasa.
   3. Lavar con PBS. Añadir 50 μL de tripsina al 0,25% por ojo e incubar durante 10 min a 37 °C. Retirar la tripsina y añadir 150 μL de medio completo por globo y raspar delicadamente las células del EPR con una pipeta Pasteur curva pulida al fuego; Use pinzas finas para inmovilizar el tejido. Recoja la suspensión celular y colóquela en un tubo de 1,5 ml. Tome 10 μL de la suspensión celular; diluir 1:4 con azul de tripán para contar las células en la cámara de Neubauer.
   4. Centrifugar las células 10 min a 120 x g.
   5. Si no se transfecta inmediatamente, siembre 200.000 células/pocillo en una placa de 24 pocillos (100.000 células/^cm2) en 1 mL de medio completo (10% FBS) (para la siembra ver Tabla 1). Coloque la placa en una incubadora y cultívela a 37 °C, 5% CO2.
      nota: Puede ser necesario juntar varios ojos para tener suficientes células para la siembra.

Resultados

especie	Tratamiento con tripsina	N° células IPE	N° células RPE	Placa para siembra (100.000 células/cm2)
conejo	Sí	~350.000	~2.500.000	Placas de 24 pocillos

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placas de 12 pocillos	Corning	353043
Placas de 24 pocillos	Corning	353047
Betadine	Mundipharma
Bonn micro pinzas planas
Pinzas Colibri (estériles)
DMEM/Ham F12	Sigma-Aldrich	D8062
Cortina (estéril)	Mölnlycke Health Care	800530
FBS	Brunschwig	P40-37500
Pinzas (de diferentes tamaños) (estériles)
Compresa de gasa	PROMEDICAL AG	25403
NaCl (0,9%)	Laboratorium Dr. Bichsel AG	1000090
Cámara de Neubauer	Marienfeld-superior	640010
Pipeta Pasteur (pulido al fuego)	Witeg	4100150
PBS 1X	Sigma-Aldrich	D8537
Penicilina/Estreptomicina	Sigma-Aldrich	P0781-100
Pentobarbital (Thiopental Inresa)	Ospedalia AG	31408025
placa de Petri	ThermoFisher Scientific	150288
Escarpel n.º 10	Swann-Morton	501
Escarpel n.º 11	Swann-Morton	503
Tijeras Bonn extrafinas curvadas con punta afilada y afilada (estériles)
Tijeras Bonn extra finas de punta afilada recta (estériles)
Tripsina 0.25%	ThermoFisher Scientific	25050014
Tijeras de muelle Vannas curvadas (estériles)