Aislamiento de células IPE y RPE: una técnica para obtener células epiteliales pigmentarias oculares a partir de ojo de conejo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

Los conejos blancos de Nueva Zelanda fueron sacrificados mediante una sobredosis de Pentobarbital (150 mg/kg) diluido en NaCl al 0,9% inyectado intraperitoneal, y los ojos fueron enucleados inmediatamente después del sacrificio.

1. Antes de la preparación

1. Prepare el medio completo (DMEM/Ham F12 suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS), 80 U/mL de penicilina / 80 μg/mL de estreptomicina y 2,5 μg/mL de anfotericina B). Calentar el medio, 1x PBS y tripsina al 0,25% (si es necesario) en un baño de agua a 37 °C.
2. Coloque un paño estéril en la campana para preparar un lugar de trabajo aséptico. Introduzca todos los instrumentos y materiales estériles necesarios dentro de la campana.
   nota: Solo la enucleación de los ojos y la limpieza del tejido muscular y la piel restantes son los procedimientos que se realizan fuera de la capucha, el resto de los pasos deben realizarse dentro de la capucha.

2. Aislamiento de células de PE de conejo

1. Utilice tijeras curvas y pinzas Colibrí para enuclear los ojos después de la eutanasia del animal. Limpie el tejido muscular restante y la piel de los ojos con tijeras y pinzas (no estériles).
   nota: El tamaño de las tijeras y pinzas utilizadas para la enucleación y limpieza de los ojos depende de la especie (por ejemplo, para ratas y ratones los instrumentos van a ser más pequeños que los utilizados para cerdos y ganado) (ver Figura 1).
   1. Recoja los ojos en un tubo de 50 ml lleno de PBS no estéril y transfiera el tubo a la campana de flujo laminar. Desinfecte los ojos sumergiéndolos durante 2 minutos en una solución a base de yodo, luego transfiéralos a una placa de Petri llena de PBS estéril.
2. Apertura de la bombilla
   1. Coloque un ojo sobre una compresa de gasa estéril y manténgala firmemente cerca del nervio óptico. Abra el ojo con el bisturí #11 y las tijeras unos 2 mm por debajo del limbo. Retire el segmento anterior (córnea, cristalino e iris) y colóquelo en una placa de Petri. Deje el bulbo con el vítreo hasta que se aíslen las células del EPR.
3. Aislamiento de células IPE
   1. Retire la lente y, con pinzas finas, extraiga delicadamente el iris que contiene las células IPE. Coloque el iris en una placa de Petri, lávela con PBS estéril y déjela en PBS hasta que se preparen más iris. Retire el cuerpo ciliar del iris cortando con un bisturí # 10.
   2. Después de la preparación de 2 iris, incubar con 1 mL de tripsina al 0,25% a 37 °C durante 10 min; durante este tiempo, se pueden aislar las células del EPR (ver paso 2.4). Retire la tripsina y añada 1 ml de medio completo al iris y aísle las células rascando cuidadosamente con una pipeta Pasteur plana pulida al fuego. Vuelva a suspender las células con cuidado pipeteando y transfiera la suspensión celular a un tubo de 1,5 ml. Tome 10 μL de la suspensión celular y diluya 1:3 con azul de tripano para contar las células en la cámara de Neubauer.
   3. Si no se transfecta inmediatamente, siembre 200.000 células/pocillo en una placa de 24 pocillos (100.000 células/^cm2) en 1 mL de medio completo (10% FBS) (para la siembra ver Tabla 1). Coloque la placa en una incubadora y cultívela a 37 °C, 5% CO2.
      nota: Puede ser necesario juntar varios ojos para tener suficientes células para la siembra.
4. Aislamiento de células EPR
   1. Extraer el humor vítreo y la retina del segmento posterior con pinzas finas. Evite dañar el epitelio pigmentario de la retina.
   2. Coloque una gasa estéril en una placa de 12 pocillos y coloque la pera sobre la gasa.
   3. Lavar con PBS. Añadir 50 μL de tripsina al 0,25% por ojo e incubar durante 10 min a 37 °C. Retirar la tripsina y añadir 150 μL de medio completo por globo y raspar delicadamente las células del EPR con una pipeta Pasteur curva pulida al fuego; Use pinzas finas para inmovilizar el tejido. Recoja la suspensión celular y colóquela en un tubo de 1,5 ml. Tome 10 μL de la suspensión celular; diluir 1:4 con azul de tripán para contar las células en la cámara de Neubauer.
   4. Centrifugar las células 10 min a 120 x g.
   5. Si no se transfecta inmediatamente, siembre 200.000 células/pocillo en una placa de 24 pocillos (100.000 células/^cm2) en 1 mL de medio completo (10% FBS) (para la siembra ver Tabla 1). Coloque la placa en una incubadora y cultívela a 37 °C, 5% CO2.
      nota: Puede ser necesario juntar varios ojos para tener suficientes células para la siembra.

Tabla 1: Número de células primarias de PE aisladas de los ojos de conejo.

Figura 1: Instrumentos utilizados para el aislamiento de PE en función de la especie. (A) Instrumentos no estériles utilizados para la enucleación de los ojos y la limpieza del tejido muscular y la piel restantes. El conjunto 1 se usa para ratas, ratones y conejos, y el conjunto 2 se usa para ojos de cerdo y ganado. (B) Instrumentos estériles utilizados para el aislamiento de PE. Tenga en cuenta los diferentes tamaños de tijeras y pinzas utilizadas según el tamaño del ojo. Las pipetas Pasteur redondas y planas pulidas al fuego se utilizan para el raspado de RPE e IPE, respectivamente.