Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado animal y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Antes de la preparación
- Prepare el medio completo (DMEM/Ham F12 suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS), 80 U/mL de penicilina / 80 μg/mL de estreptomicina y 2,5 μg/mL de anfotericina B). Calentar el medio, 1x PBS y tripsina al 0,25% (si es necesario) en un baño de agua a 37 °C.
- Coloque un paño estéril en la campana para preparar un lugar de trabajo aséptico. Introduzca todos los instrumentos y materiales estériles necesarios dentro de la campana.
NOTA: Solo la enucleación de los ojos y la limpieza del tejido muscular y la piel restantes son los procedimientos que se realizan fuera de la capucha, el resto de los pasos deben realizarse dentro de la capucha.
- Los ojos de cerdo se obtuvieron de un matadero local dentro de las 6 horas posteriores al sacrificio y se transportaron al laboratorio en hielo
2. Aislamiento de células de PE de cerdo
- Utilice tijeras curvas y pinzas Colibrí para enuclear los ojos después de la eutanasia del animal. Limpie el tejido muscular restante y la piel de los ojos con tijeras y pinzas (no estériles).
nota: El tamaño de las tijeras y pinzas utilizadas para la enucleación y limpieza de los ojos depende de la especie (por ejemplo, para ratas y ratones los instrumentos van a ser más pequeños que los utilizados para cerdos y ganado) (ver Figura 1).
- Recoja los ojos en un tubo de 50 ml lleno de PBS no estéril y transfiera el tubo a la campana de flujo laminar. Desinfecte los ojos sumergiéndolos durante 2 minutos en una solución a base de yodo, luego transfiéralos a una placa de Petri llena de PBS estéril.
- Después de transferir los ojos a una placa de Petri estéril, sostenga uno firmemente cerca del nervio óptico con Colibrí o pinzas puntiagudas. Haz un agujero cerca del límite del iris (entre la pars plana y la ora serrata) con una aguja de 18 G. Inserta unas tijeras pequeñas en el agujero y corta alrededor del iris. Retire el segmento anterior (córnea, cristalino e iris) y colóquelo en una placa de Petri. Deje el bulbo con el vítreo hasta que se aíslen las células del EPR.
3. Aislamiento de células IPE
- Retire el cuerpo ciliar del iris cortando con un bisturí # 10. Después de la preparación de 2 iris, agregue 1 mL de medio completo y aísle las células rascando cuidadosamente con una pipeta Pasteur plana pulida al fuego. Transfiera la suspensión celular a un tubo de 1,5 mL. Tome 10 μL de la suspensión celular y diluya 1:4 con azul de tripán para contar las células en la cámara de Neubauer.
- Si no se transfecta inmediatamente, siembre 200.000 células/pocillo en una placa de 24 pocillos (100.000 células/cm2) en 1 mL de medio completo (10% FBS) (para la siembra ver Tabla 1). Coloque la placa en una incubadora y cultívela a 37 °C, 5% CO2.
nota: Puede ser necesario juntar varios ojos para tener suficientes células para la siembra.
4. Aislamiento de células EPR
- Realice el paso 1.1.1. Coloque la bombilla en una placa de Petri y lave con PBS. Llene la bombilla con 1 mL de medio completo.
- Con una pipeta Pasteur curva pulida al fuego, retire con cuidado las células del EPR. Asegúrese de raspar de abajo hacia arriba para evitar deslizarse hacia abajo del complejo de membrana de Coroides-Bruch. Recoja la suspensión celular dentro del bulbo con una pipeta de 1.000 μL y transfiérala a un tubo de 1,5 mL para su resuspensión. Tome 10 μL de la suspensión celular y diluya 1:8 con azul de tripano para contar las células en la cámara de Neubauer.
- Células semilla como se describe en el paso 3.2.
