Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Esterilización
- PASO CRÍTICO: Desinfectar todas las pinzas y tijeras remojando durante 1 h en solución al 5% (v/v) de Distel en agua destilada, limpiar con un cepillo, enjuagar con agua del grifo y esterilizar en horno a 185 °C durante un mínimo de 2 h.
- Esterilice todos los demás artículos de vidrio y reactivos esterilizándolos en autoclave a 121 °C durante 15 minutos o prepare los reactivos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Llevar a cabo los siguientes procedimientos en un gabinete de seguridad microbiológica de clase II.
2. Recogida de muestras
- Colección de ojos porcinos
- Cerdas autóctonas blancas de gran tamaño, se utilizó un cruce con un jabalí de Hampshire. Los animales fueron aturdidos con una corriente eléctrica y los ojos fueron enucleados 2 h después en el matadero.
- PASO CRÍTICO: Una vez enucleados, transfiera los ojos al laboratorio en una solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) para evitar que se sequen y procéselos inmediatamente después de su llegada.
3. Preparación del botón corneoescleral
- Use pinzas estériles para sostener el tejido que rodea el globo ocular y transfiéralo a una placa de Petri. Retire la conjuntiva y el tejido muscular alrededor del globo ocular en una placa de Petri con la hoja de bisturí n.º 15 y pinzas.
- Levante suavemente el globo ocular mientras sujeta el nervio óptico con pinzas y transfiéralo a un frasco de 0,5 L lleno de PBS estéril.
- Una vez que todos los ojos estén despejados del tejido circundante, muévalos con pinzas estériles a otro frasco de 0,5 L lleno de povidona yodada al 3% (v/v) en PBS y déjelo actuar durante 1 min.
- Transfiera los globos oculares a otro frasco de 0,5 L con PBS estéril.
- Use fórceps para mantener el ojo quieto en una placa de Petri y haga un corte cerca de la córnea con una hoja de bisturí no 10A.
- PASO CRÍTICO: Sostenga el borde del corte y use tijeras para extirpar la córnea dejando aproximadamente 3 mm de esclerótica alrededor de la córnea. Asegúrese de que el extremo afilado de las tijeras no perfore el iris o el tejido coroideo y esté en el espacio supracoroideo.
- Sostenga el botón corneoescleral con pinzas y use otro par de pinzas puntiagudas para separar suavemente el tejido uveal.
- Levante el botón corneoescleral del globo restante y enjuáguelo brevemente con una solución de povidona yodada al 1,5% (v/v) en PBS en una placa de 12 pocillos.
- Coloque el botón corneoescleral en otra placa de 12 pocillos llena de PBS estéril.
