Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE
1. Preparación de un inóculo
- Vierta 10 mL de caldo LB en un matraz cónico de 50 mL con tapón de espuma.
- Transfiera una colonia de P. aeruginosa cepa PAO1 o cepa PA14 de una placa de agar fresca e incube a 37 °C durante 3-4 h hasta que las bacterias estén en la fase media de logaritmo.
- Transfiera el cultivo de bacterias a un tubo de 50 mL y centrifugue a 3.000 x g durante 5 min. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en PBS.
- Repita el paso 1.3 dos veces más para lavar las células. Vuelva a suspender el pellet de celda en PBS y ajuste la densidad óptica a 600 nm a aproximadamente 0,6 utilizando PBS estéril como blanco.
2. Infectando el botón corneoescleral
- Retire los medios de la placa de Petri y enjuague las córneas dos veces con 1 ml de PBS estéril.
- Apriete suavemente las pinzas mientras sostiene la córnea en el medio. Utilice un bisturí de 10A para hacer cuatro cortes, dos verticales y dos horizontales, en la sección central del botón corneoescleral a través de la capa epitelial hasta el estroma subyacente.
- Coloque un molde de vidrio estéril en una placa de 6 pocillos con la parte ancha hacia arriba y coloque la córnea en el medio del molde de vidrio, con el lado del epitelio hacia abajo. Haz el corte justo en el centro de la parte inferior del molde de vidrio.
- PASO CRÍTICO: Vierta 1 mL de agar de bajo punto de fusión al 1% (p/v) disuelto en DMEM para llenar completamente el molde de vidrio con córnea.
- Deje que el agar se asiente y luego invierta el molde de vidrio para que el epitelio corneal quede hacia arriba.
- Pipetear 15 μL del cultivo bacteriano con DE600 nm = 0,6 (para P. aeruginosa esto equivale aproximadamente a 1 x 107 unidades formadoras de colonias (UFC) en 15 μL) directamente en un área de corte y luego agregar 85 μL de PBS en la parte superior para mantener húmedo el epitelio corneal. Diluya el cultivo bacteriano restante y póngalo en agar para contar las unidades formadoras de colonias para el inóculo.
- Agregue 1 mL de DMEM sin antibióticos al fondo de cada pocillo con el molde de vidrio. Incubar la placa de 6 pocillos con los botones corneoesclerales infectados en una incubadora humidificada a 37 °C con 5% de CO2 durante un máximo de 24 h.
- Configure córnea de control no infectada junto con cada experimento. Para establecer un control no infectado, sustituya los 15 μL de cultivo bacteriano del paso 2.6 por PBS estéril.
