Modelo de biopelícula pulmonar de cerdo ex vivo: una técnica para desarrollar un modelo pulmonar para estudiar biopelículas bacterianas en tejido bronquiolar de cerdo

Resumen

Fuente: Harrington, N.E. et al., Pruebas de eficacia antibiótica en un modelo ex vivo de biopelículas de Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus en el pulmón de fibrosis quística. J. Vis. Exp. (2021).

Este video describe el protocolo para desarrollar un modelo de pulmón de cerdo ex vivo de biofilm bacteriano en tejido bronquiolar infectado. Las biopelículas son agregados bacterianos incrustados en una matriz adherida a una superficie. Este modelo se utiliza para estudiar la susceptibilidad antibiótica de las bacterias en diferentes etapas de la formación de la biopelícula.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Disección e infección de tejido pulmonar de cerdo ex vivo (EVPL)

1. Prepare SCFM para usar con tejido EVPL, siga la receta de SCFM modificado de 1 L suministrado en la Tabla 1.
2. Antes de la disección, prepare una placa de agar con las cepas bacterianas requeridas para la infección utilizando cualquier agar que sea estándar en el laboratorio para P. aeruginosa/S. aureus (por ejemplo, caldo de lisogenia + agar al 1,2%).
3. Calcule cuántas piezas de tejido bronquiolar porcino se necesitan para el experimento, incluidas las piezas de tejido de control no infectadas. Multiplique este número por dos para repetir el experimento en dos pulmones replicados para confirmar la repetibilidad de los resultados.
4. Multiplique el número total de piezas de tejido necesarias por 0,5 para determinar el volumen de agarosa SCFM (mL) necesario para hacer almohadillas de agarosa para producir suficiente medio para 400 μL/pieza de tejido más agar SCFM de repuesto para tener en cuenta cualquier error de pipeteo o evaporación durante la preparación.
5. Agregue 0,12 g de agarosa a cada 15 mL de SCFM necesarios para producir el volumen total deseado de SCFM con 0,8% de peso/volumen de agarosa.
6. Caliente la solución de agarosa SCFM hasta que la agarosa se disuelva por completo. Se recomienda un microondas doméstico a baja potencia. El tiempo requerido depende de la potencia del microondas. Deje que la agarosa se enfríe a aproximadamente 50 °C (tibia al tacto pero cómoda de sostener). No permita que se enfríe más.
7. Con una pipeta, agregue 400 μL de agarosa SCFM a un pocillo de una placa de 24 pocillos por pieza de tejido necesaria.
8. Esterilice la placa de 24 pocillos que contiene agarosa SCFM bajo luz ultravioleta durante 10 min.
9. Prepare tres lavados repetidos para cada pulmón intacto que se diseccione utilizando 20 mL de medio Eagle modificado estéril de Dulbecco (DMEM) más 20 mL de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 estéril suplementado con 50 μg/mL de ampicilina.
10. Haga una alícuota de 40 mL de SCFM como lavado final para cada pulmón intacto que se esté diseccionando. Todos los lavados pueden almacenarse durante la noche a 4 °C o utilizarse inmediatamente.
11. Obtenga los pulmones de la fuente designada tan pronto como sea posible después del sacrificio, asegurándose de que se mantengan fríos transportándolos al laboratorio en una nevera doméstica><. nota: Los pulmones más cercanos al día del sacrificio muestran menos hematomas durante el almacenamiento, pero también se puede utilizar tejido mantenido en almacenamiento en frío hasta 4 días después del sacrificio. Dado que la nevera portátil debe llevarse a la carnicería o al matadero, debe descontaminarse siguiendo las pautas del laboratorio local después de cada uso y almacenarse fuera del laboratorio de microbiología cuando no esté en uso, para reducir el riesgo de contaminación y violación de la contención.
12. Trabajando sobre una superficie esterilizada y bajo una llama, coloque los pulmones sobre una tabla de cortar de plástico limpia cubierta con papel de aluminio esterilizado en autoclave. Comprueba que los bronquiolos permanezcan intactos. Si ha habido algún daño en el matadero o durante el transporte, los pulmones no son adecuados para su uso.
13. Caliente una espátula bajo una llama y toque muy brevemente el cuchillo en el área del pulmón que rodea el bronquiolo para esterilizar la superficie del tejido.
14. Corte el tejido superficial que rodea el bronquiolo con una cuchilla de afeitar estéril montada. Haga incisiones paralelas al bronquiolo para evitar cualquier daño.
15. Una vez que el bronquiolo haya sido expuesto, haga una incisión transversal a través del bronquiolo en el punto más alto visible para liberar el bronquiolo.
16. Con pinzas estériles, sostenga ligeramente el extremo libre del bronquiolo y corte cualquier tejido no deseado restante con una hoja de afeitar montada estéril. Haga una incisión transversal final a través del bronquiolo antes de que se vea cualquier ramificación para extirpar el bronquiolo de los pulmones.
17. Coloque el bronquiolo en el primer lavado DMEM/RPMI 1640. Deje el bronquiolo en el lavado y repita los pasos 1.12 a 1.15 para recolectar secciones adicionales de bronquiolo del mismo pulmón según sea necesario para producir suficientes secciones de tejido para el experimento planeado.
18. Coloque cualquier sección bronquiolar adicional del mismo pulmón en el lavado (paso 1.17). Dejar lavar durante al menos 2 min.
19. Retire los bronquiolos del primer lavado DMEM/RPMI 1640 y coloque las muestras en una placa de Petri estéril.
20. Sostenga cada bronquiolo ligeramente con pinzas estériles, asegurándose de no dañar el tejido. Retire la mayor cantidad posible de tejido blando restante y corte el tejido en tiras de ~ 5 mm de ancho con tijeras de disección estériles.
21. Coloque todas las tiras de tejido bronquiolar en el segundo lavado DMEM/RPMI 1640. Dejar lavar durante al menos 2 min.
22. Retire las tiras de tejido del segundo lavado con pinzas estériles, teniendo cuidado de no dañar el tejido. Coloque el pañuelo en una placa de Petri limpia y estéril.
23. Retire cualquier tejido blando restante adherido al bronquiolo y corte las tiras en cuadrados (~ 5 mm x 5 mm) con tijeras de disección estériles.
24. Agregue el tercer lavado DMEM/RPMI 1640 en la placa de Petri. Mezcle ligeramente los trozos de pañuelo en el lavado girando el plato.
25. Vierta el tercer lavado fuera de la placa de Petri sin quitar los trozos de tejido.
26. Agregue el lavado final de SCFM a la placa de Petri que contiene pañuelo, asegurándose de que todas las piezas de tejido estén cubiertas.
27. Esterilice las piezas de tejido en SCFM bajo luz ultravioleta durante 5 min.
28. Utilice pinzas estériles para transferir cada pieza de tejido bronquiolar esterilizado a pocillos individuales de una placa de 24 pocillos que contiene almohadillas de agarosa SCFM.
29. Para infectar cada pieza de tejido con la cepa bacteriana deseada, toque una colonia cultivada en una placa de agar con la punta de una aguja de 29 G unida a una jeringa de insulina estéril de 0,5 mL. A continuación, toque la colonia sobre la pieza de tejido, pinchando suavemente la superficie del tejido.
    nota: El uso de una jeringa de insulina equipada con una aguja de 29 G permite sujetar la aguja de manera precisa y cómoda mientras se mantienen los dedos a una distancia segura de la aguja y el tejido pulmonar. Es posible realizar este paso utilizando agujas de 29 G que no están unidas a una jeringa, pero esto requiere una mayor destreza y aumenta el riesgo de una lesión por pinchazo de aguja. Las jeringas de insulina están fácilmente disponibles.
30. Para los controles no infectados, pinche suavemente la superficie de cada una de las piezas de tejido con la punta de una aguja de 29 G unida a una jeringa de insulina estéril de 0,5 mL.
31. Utilice una pipeta para añadir 500 μL de SCFM a cada pocillo.
32. Esterilice una membrana de sellado transpirable para cada placa de 24 pocillos bajo luz ultravioleta durante 10 minutos (Tabla de materiales).
33. Retire la/s tapa/s de la/s placa/s de 24 pocillos y reemplácela con la membrana transpirable.
34. Incubar las placas a 37 °C durante el tiempo de incubación (infección) deseado sin agitar. Verifique que no haya crecimiento visible del patógeno inoculado en las piezas de control no infectadas (control de contaminación).
    nota: Si se desea, se puede agregar ampicilina a las almohadillas de agarosa SCFM y cubrir SCFM en el paso 1.31 hasta una concentración final de 20 μg/mL. Esto suprimirá el crecimiento de la mayoría de las bacterias endógenas en los pulmones sin afectar el crecimiento de P. aeruginosa o S. aureus, pero, como la presencia de ampicilina puede afectar la susceptibilidad a otros antibióticos, el lector debe tomar esta decisión dependiendo de las cepas y los antibióticos que desee probar.

>TABLA 1

1. Preparación de medios sintéticos de esputo CF (SCFM) para su uso con modelos de pulmón de cerdo ex vivo

Una vez fabricado, el SCFM debe esterilizarse con filtro y luego puede almacenarse a 4°C hasta por un mes.

horas

a) Receta principal
Paso 1	químico	importe	instrucciones	MM final en SCFM de 1L
	NaCl	3,03 g	Agregue sales y agua a la botella limpia, utilizada solo para la preparación de SCFM	51.85
	Kcl	1.114 g		14.94
	dH2O	640 ml		N/A
Paso 2	químico	Molaridad del material elaborado en agua, esterilizado por filtro y almacenado a 4°C	instrucciones	MM final en SCFM de 1L
	Na2HPO4	0,125 m	Añadir 10 ml de cada caldo a las sales y al agua preparados en el paso 1	1.25
	NaH2PO4	0,13 m		1.30
	NH4Cl	0,228 m		2.28
	KNO3	0,0348 M		0.35
	K2SO4	0,0271 M		0.27
	Mops	1 M		10.00
Paso 3	químico		instrucciones	MM final en SCFM de 1L
	19 soluciones de aminoácidos preparadas según la sección b)		Añadir 10 ml de cada caldo a la solución preparada en los pasos 1 y 2.	Ver apartado b)
Paso 4	Químico		instrucciones	MM final en SCFM de 1L
	HCl o NaOH según sea necesario		Úselo para ajustar el pH de la solución preparada en los pasos 1-3 a 6.8. Registre el volumen de ácido/base añadido.	N/A
Paso 5	Químico		instrucciones	MM final en SCFM de 1L
	dH2O		Añadir a la solución preparada en los pasos 1-4, hasta un volumen final de 960 ml	N/A
Paso 6	químico	Molaridad del material elaborado en agua, esterilizado por filtro y almacenado a 4°C	instrucciones	MM final en SCFM de 1L
	CaCl2	0,175 m	Añadir 10 ml de cada caldo a la solución preparada en los pasos 1-5	1.75
	MgCl2	0,0606 m		0.61
Paso 7	químico	Molaridad del material elaborado en agua, esterilizado por filtro y almacenado a 4°C	instrucciones	MM final en SCFM de 1L
	Ácido L-láctico	0,93 m	Hacer caldo en agua, pH a 7 con 5M NaOH. Añadir 10 ml a la solución preparada en los pasos 1-6.	9.30
Paso 8	químico	Molaridad del caldo de trabajo hecho en agua, inmediatamente antes de agregar a la receta	instrucciones	MM final en SCFM de 1L
	Fe(III)SO4.7H2O	0,00036 m	Hacer un material maestro de 0,036 M, que se puede esterilizar con filtro y almacenar a 4 °C mientras la solución permanezca libre de precipitado. Para hacer el material de trabajo, agregue 110 μl del material maestro a 9.890 ml de dH2O y agregue el material de trabajo a la solución preparada en los pasos 1-7.	0.0036

b) Preparación de caldos de aminoácidos; filtrar, esterilizar antes de usar y almacenar a 4°C.
aminoácido	Stock mM	instrucciones	mM final en SCFM de 1 L
alanina	Artículo 178	Disolver en agua	1.780
arginina	30.6	Disolver en agua	0.306
aspartato	Artículo 82.7	Disolver en NaOH 0,5 M	0,827
cisteína	16	Disolver en agua	0,160
ácido glutámico	Artículo 154.9	Disolver en 1 m de HCl	1.549
glicina	Artículo 120.3	Disolver en agua	1.203
histidina	51.9	Disolver en agua	0.519
isoleucina	Artículo 112.1	Disolver en agua calentando a 50 °C durante 30 minutos en una coctelera	1.121
leucina	160.9	Disolver en agua	1.609
lisina	Artículo 212.8	Disolver en agua	2.128
metionina	Artículo 63.3	Disolver en agua	0,633
Ornitina-HCl	Artículo 67.6	Disolver en agua	0,676
fenilalanina	53	Disolver en agua	0,530
prolina	Artículo 166	Disolver en agua	1.660
serina	Artículo 144.6	Disolver en agua	1.446
treonina	Artículo 107.2	Disolver en agua	1.072
triptófano	1.3	Disolver en NaOH 0,2 M	0.013
tirosina	Artículo 80.2	Disolver en NaOH 1M	0,802
valina	Artículo 111.7	Disolver en agua	1.117

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Jeringas de insulina: 0,5 ml con aguja de 29G conectada.	VWR	BDAM324892
Placas de cultivo de 24 pocillos
Etanol al 70% o similar para la esterilización de superficies y el flameado de equipos de disección
Placas de agar para preparar vetas de P. aeruginosa/S. aureus (cualquier medio adecuado)
agarosa
Papel de aluminio, preesterilizado en autoclave, para cubrir la tabla de cortar en la que se diseccionarán los pulmones.
Membrana de sellado Breathe-easy o Breathe-easier para placas de pocillos múltiples	Biotecnología diversificada	BEM-1 o BERM-2000
Mechero de bunsen
Tabla de cortar: recomendamos una tabla de plástico para permitir una fácil descontaminación con alcohol.
Nevera portátil para transportar pulmones al laboratorio
Tijeras de disección en diferentes tamaños
Medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM)
Cuchillo para palets grandes
Hojas de afeitar montadas
Placas de Petri
Tabla de cortar de plástico y papel de aluminio para crear una superficie de disección estéril y fácil de limpiar
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 mediano
Scfm			Ingredientes enumerados en la Tabla 1
Selección de pinzas (se recomiendan puntas romas)
Recipientes adecuados para desechar objetos punzocortantes y tejido pulmonar de cerdo contaminados, de acuerdo con el > de su institución