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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Disección de tejido
- Prepare el tejido porcino utilizando un espacio de disección no estéril.
- Procure ojos porcinos enucleados de un matadero local, estudios de animales o proveedor. Mantenga los ojos en el hielo sumergidos en PBS durante la entrega y utilícelos inmediatamente después de recibirlos.
- Cortar el tejido extraorbitario y recortar la conjuntiva, dejando solo la concha corneoescleral y el nervio óptico. Realice la disección en condiciones no estériles con tijeras quirúrgicas grandes y pinzas en un paquete de herramientas de disección macroscópica.
- Vuelva a colocar los ojos en PBS fresco sobre hielo hasta que todos los ojos necesarios para la configuración experimental hayan sido diseccionados preliminarmente / macroburdos.
- Sumerja los ojos en una solución de betadine al 10% durante 2 minutos en recipientes cerrados y transfiéralos asépticamente al gabinete BSC II para microdisección (gabinete # 1). Realice todos los trabajos posteriores en condiciones estériles para minimizar las contaminaciones durante la configuración.
- Diseccionar estérilmente los segmentos anteriores.
- Después de 2 min en solución de betadine, transfiera los ojos a tres lavados en serie de 1x Antibiótico-Antimicótico-PBS ESTÉRIL (AA-PBS) para eliminar el exceso de solución de betadine de la superficie ocular mientras se mantiene la esterilidad del tejido ocular. Después de tres lavados, mantenga el tejido en AA-PBS hasta su uso posterior.
- Extirpa el ojo con una hoja de afeitar/bisturí y unas tijeras curvas. Coloque el ojo sobre una gasa empapada en AA-PBS y haga una incisión con una hoja de afeitar estéril o un bisturí cerca del ecuador del ojo (dividido 60/40 con 40 en el lado anterior). Con unas tijeras quirúrgicas curvas, hemiseccione el ojo para aislar el ojo anterior (mitad de la córnea).
nota: El corte alrededor del segmento anterior debe ser continuo para evitar bordes irregulares y ásperos en la esclerótica que crearán fugas de líquido después de la instalación en el cultivo de órganos.
- Use microtijeras como pala para extraer el humor vítreo del segmento anterior. Retire el cristalino del segmento anterior con unas microtijeras. Deje los segmentos anteriores en AA-PBS hasta los siguientes pasos de disección.
nota: Todos los ojos que se van a diseccionar se pueden sostener en este paso y uno por uno pasar el resto del proceso de disección.
- Con un microscopio de disección, corte el iris hasta la raíz del iris gradualmente, radialmente hasta que la malla trabecular (TM) sea visible. El TM es un tejido pigmentado que comprende fibras orientadas circunferencialmente alrededor de la concha corneoescleral. Los cortes cuidadosos en el iris hacia la raíz del iris expondrán la profundidad de la MT debajo del tejido.
- Corta 360° alrededor del iris a la misma profundidad que el corte inicial en el tejido para exponer toda la región de la MT. Limpie cualquier resto de iris residual que cubra TM según sea necesario.
- Recorte los restos del cuerpo ciliar posteriores a la MT, dejando solo una banda delgada de tejido posterior a la región de la MT (aproximadamente 1 mm).
- Coloque el segmento anterior (AS) disecado en un medio hasta su posterior instalación en el cultivo de órganos del segmento anterior (ASOC) en el gabinete BSC II (gabinete # 2).
nota: Todos los ojos se pueden mantener en este punto antes de la configuración de ASOC si un solo usuario está realizando la disección y el ensamblaje de la placa de cultivo de órganos.