Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Configuración de segmentos anteriores en placas de cultivo de órganos
- Coloque un solo segmento anterior (AS) en una placa de Petri con AS invertido (copa hacia arriba). Con un hisopo de algodón, humedezca el medio y frote suavemente en el centro de la córnea para eliminar cualquier pigmento. Con pinzas para sujetar el ojo y el mismo hisopo, limpie el hisopo de algodón alrededor de la esclerótica para eliminar el pigmento adicional.
- Invierta el AS y colóquelo en la parte superior de la parte inferior de la placa sobre la región elevada, centrando la córnea sobre la región elevada en la placa. Coloque el anillo de sujeción encima del AS recién colocado.
- Coloque cuatro tornillos en los orificios correspondientes para mantener el anillo en su lugar con el AS debajo del anillo. Apriete suavemente los tornillos a mano con la llave L.
nota: El paso de apriete se realizará diariamente durante todo el experimento, por lo que el objetivo del apriete inicial aquí es garantizar que el medio no tenga fugas y evitar romper el anillo de sujeción.
- Con un juego de placas de Petri estériles, coloque la parte superior sobre la placa e invierta la configuración. Coloque el soporte para platos. Conecte los conectores fluídicos con juntas tóricas a los puertos roscados en la parte inferior del plato.
- A un conector fluídico, conecte un cubo de aguja doblado de 18 G a 90°, un trozo de tubo, un cubo de aguja de 18 G, un filtro de jeringa de nylon, una válvula de tres vías y una jeringa de 20 ml llena de medios.
- Al segundo conector fluídico, conecte un cubo de aguja doblado de 18 G a 90° grados, la longitud del tubo, un cubo de aguja de 18 G, una válvula de tres vías y la parte del cilindro de una jeringa estéril de 10 mL (esto actuará como un depósito para atrapar el líquido y las burbujas del ASOC).
- Con las válvulas de tres vías abiertas adecuadamente a las jeringas, empuje suavemente los medios a través del sistema utilizando el puerto del conector de fluidos identificado en el paso 1.5 para inflar el AS, llenar los medios en la tubería y, finalmente, el depósito><.
nota: Si el medio se filtra en la placa ASOC, el AS no está asegurado lo suficientemente apretado con el anillo de sujeción.
- Elimine las burbujas empujando suavemente el medio en el plato e invirtiendo el plato para empujar las burbujas hacia el depósito.
- Coloque el plato y párese en posición vertical. Coloque la parte inferior de una placa de Petri debajo de los pies del soporte, con cuidado de no enredar el tubo.
2. Inicio del cultivo de órganos del segmento anterior
- ASOC ya está listo para la incubación. Coloque la placa ASOC en la incubadora de cultivos celulares (37 °C, 5% CO2). Asegúrese de que se conozca y tenga en cuenta la altura de la placa ASOC en la incubadora por encima de los transductores de presión para calcular la presión intraocular (PIO) con precisión.
- Dirija las líneas de tubos a través de la parte inferior de la puerta de la incubadora a 37 °C, 5% de CO2 para que no interfieran con la apertura y el cierre de la puerta. Conecte la jeringa de 20 ml a la bomba de jeringa ajustada a 2,5 μl/min.
- Coloque la línea de tubería con el depósito en el instrumento del transductor de presión. Conecte la válvula lateral de 3 vías a la configuración del transductor de presión mientras fluye PBS a través de la línea para evitar que entren burbujas de aire en las líneas de tuberías.
nota: Vacíe el PBS de los depósitos después de configurar el sistema para reducir la probabilidad de contaminación del depósito con crecimiento microbiano durante la duración del cultivo de órganos.
- Inicie la recopilación de datos de IOP asegurándose primero de que haya una tarjeta microSD para guardar los archivos de datos. Luego, encienda la configuración del transductor de presión para comenzar la recopilación de datos.
3. Mantenimiento diario de ASOC
- Después de que el ASOC haya tenido 24 horas para equilibrarse, retire las placas de la incubadora a 37 °C, 5% de CO2 y colóquelas en el gabinete de bioseguridad (BSC) II><.
nota: En la adquisición de datos de presión, estos períodos de tiempo parecen picos a medida que los ASOC se retiran de la incubadora (cambio de altura) y se ajustan en el gabinete.
- Verifique si hay fugas debajo de cada plato en la placa de Petri. Si están presentes, verifique que las conexiones fluídicas estén bien ajustadas debajo del plato y vuelva a apretar si es necesario. Compruebe si hay fugas en la parte superior del plato con una llave en L estéril para apretar los tornillos del anillo de sujeción.
nota: El tejido esclerótico AS se comprimirá y reducirá el grosor en 24 horas, y será necesario apretar el anillo de sujeción.
- Aspire bien el medio del plato.
nota: La malla trabecular filtra el fluido de los medios que se bombean al ASOC. Por lo tanto, los medios estarán presentes en el plato ASOC a lo largo de los bordes.
- Repita los pasos 1.7 y 1.8 para eliminar las burbujas de aire atrapadas.
- Rellene las jeringas en las bombas de jeringa, asegúrese de que las bombas de jeringa estén funcionando y confirme la alineación de las válvulas para la perfusión en el ASOC. Regrese la placa ASOC a la incubadora a 37 °C, 5% de CO2.
nota: Lo ideal es que estos pasos se realicen a diario. Sin embargo, el uso de un volumen inicial de 20 mL de medio, el volumen del pocillo de la placa ASOC y una velocidad de bombeo de 2,5 μL/min debería ser suficiente para que el sistema funcione durante varios días sin interrupciones.
