Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Corte de tejido de corazón de cerdo
- Configure el baño de pañuelos en el vibratomo, agregue hielo a la camisa de enfriamiento del baño de tejidos, luego agregue la solución de Tyrode en el baño de tejidos. Coloque un frasco de plástico de 1 L para recoger la eliminación de hielo derretido de la camisa de enfriamiento del baño de tejidos. Para 1 L de la solución de Tyrode para cortar, mezcle 3 g/L de monóxido de 2,3-butanediona (BDM), 140 mM de NaCl (8,18 g), 6 mM de KCl (0,447 g), 10 mM de D-glucosa (1,86 g), 10 mM de HEPES (2,38 g), 1 mM de MgCl2 (1 mL de solución 1 M), 1,8 mM de CaCl2 (1,8 mL de solución 1 M), hasta 1 L de ddH2O. Ajuste el pH a 7.40 usando NaOH. A continuación, filtre la solución utilizando un sistema de filtro/almacenamiento al vacío de 1.000 ml y 0,22 μm y almacene a 4 °C durante la noche.
- Debajo de la cabina de bioseguridad, transfiera el corazón de cerdo a una bandeja que contenga 1 L de solución cardiopléjica fría fresca. Para 1 L de la solución cardiopléjica, mezcle 110 mM de NaCl (6,43 g), 1,2 mM de CaCl2 (1,2 mL de solución 1 M), 16 mM de KCl (1,19 g), 16 mM de MgCl2 (3,25 g), 10 mM de NaHCO3 (0,84 g), 1 U/mL de heparina, hasta 1 L de ddH2O. Ajuste el pH a 7,40 usando NaOH. A continuación, filtre la solución utilizando un sistema de filtro/almacenamiento al vacío de 1.000 ml y 0,22 μm y almacene a 4 °C durante la noche.
nota: Añadir 1.000 U/L de heparina en solución para cardioplejia el día del corte.
- Diseccionar el corazón para aislar el ventrículo izquierdo con bisturíes estériles retráctiles. Luego, corte el ventrículo izquierdo en bloques de 1-2 cm3 cada uno con hojas rectangulares de afeitar. Use una pieza para cortar y mantenga las piezas restantes en un tubo de 50 ml en una solución fría de Tyrode sobre hielo para cortar más tarde, si es necesario><.
nota: Masajee el pañuelo antes de cortar con las manos, especialmente si este es el segundo bloque. El masaje ayuda a restaurar la configuración correcta de las fibras musculares y previene cualquier rigidez dentro del bloqueo cardíaco.
- Agregue 1-2 gotas de pegamento para tejidos (Tabla de materiales) al portamuestras de metal y pegue un trozo del bloque de agar al 4% con una superficie de aproximadamente 1 cm2.
- Agregue 1-2 gotas de pegamento para tejidos en el agar.
- Pegue el bloque cardíaco al agar con el lado del epicardio cardíaco hacia abajo sobre el pegamento tisular y asegúrese de que esté lo más plano posible. A continuación, transfiera el soporte de pañuelos con el bloque cardíaco a su posición en el baño de corte del vibrátomo.
- Conecte el tubo de oxígeno al baño de corte y la bandeja de metal llena con la solución de Tyrode para recoger las rodajas (baño de Tyrode oxigenado). A continuación, añada 40 μm de coladores de células en la bandeja metálica para recoger las rodajas después del corte.
- Ajuste de la posición de corte
- Utilizando el software de funcionamiento del vibratomo y el salpicadero, ajuste la altura de la cuchilla/muestra. Seleccione el botón de altura y siga las instrucciones en pantalla para ajustar la altura. Lo ideal es tener la cuchilla cerca de la parte superior del tejido, pero por debajo de los músculos papilares, y asegurarse de que haya líquido que cubra el tejido y la cuchilla antes de cortar.
- Ajuste dónde comenzar a cortar el pañuelo seleccionando el botón de avance. Presione el botón de corte y aumente la velocidad usando la perilla para mover la cuchilla hacia el borde del pañuelo. Luego, presione cortar nuevamente para detenerse y presione el botón de avance para desactivar el proceso.
- Ajuste los parámetros de corte: velocidad de avance = 0,03 mm/s, frecuencia de vibración = 80 Hz y amplitud de vibración horizontal = 2 mm. A continuación, comience a cortar seleccionando el botón de corte.
- Deje que el vibratomo corte hasta que llegue al final del tejido, pero antes de que golpee el extremo posterior del portamuestras. En este punto, presione cortar nuevamente para detenerse. Presione el botón Regresar para volver a la posición inicial.
- Seleccione la repetición automática (haciendo clic dos veces), lo que permitirá que el micrótomo vibratorio repita automáticamente el proceso de corte hasta 99 veces.
- Recolección de rebanadas
- Espere hasta que las rodajas estén completas y se vean bien (después de pasar las capas de músculo papilar), luego comience a recolectar las rodajas.
- Recoja las rodajas con una pipeta Pasteur de plástico rellena con solución fría de Tyrode para agarrar suavemente el pañuelo del baño. Si es necesario, use fórceps y tijeras de resorte para disociar el corte del bloqueo cardíaco si el tejido aún está unido.
- Transfiera el corte a un colador de células en el baño de Tyrode oxigenado (consulte el paso 1.7) y use el líquido de la pipeta de plástico Pasteur para que el tejido quede plano sobre uno de los filtros de celdas, luego agregue una arandela de metal en la parte superior para sujetar el tejido.
