Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Aislamiento de complejos cúmulo-ovocito porcino
- Con el fin de recolectar material para el aislamiento de folículos ováricos, se extrajeron ovarios porcinos de primerizas prepúberes (aproximadamente de 6-7 meses de edad, con un peso de 70 a 80 kg) en un matadero local. Elija aproximadamente 20 ovarios de cerdo de 10 animales para el aislamiento de complejos cúmulo-ovocito (COC) en cada experimento.
nota: Suponiendo que cada ovario produce de 3 a 5 folículos, el número total de folículos varía de 60 a 100.
- Colocar los ovarios en un termo con solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS; pH 7,4; 38 °C) que contenga una solución antimicótica (AAS) al 1%. Asegúrese de que el material experimental se transporta al laboratorio en el plazo de 1 hora, donde se enjuaga dos veces con PBS estéril que contenga antibióticos.
- Después de enjuagar los ovarios, transfiéralos al vaso de precipitados lleno de medio de manipulación (HM) (Tabla de Materiales) y guárdelos en una incubadora a 38 °C durante el tiempo de todas las manipulaciones><.
nota: Para obtener resultados óptimos durante la manipulación de ovocitos, realizar todos los procedimientos en medio DMEM/F12 (medio de manipulación, HM) con la adición de un 2,5% de antibiótico/AAS y un 10% de suero fetal bovino (FBS) y controlar el pH al nivel de CO2 en el ambiente, en una mesa de calentamiento con control de temperatura (38 °C) y bajo la campana de flujo laminar para minimizar la contaminación bacteriana.
- De folículos porcinos grandes (6-8 mm de diámetro) se recoge líquido folicular (FF) por aspiración y centrifugación a 100 x g durante 10 min a temperatura ambiente. Después de eso, filtre el sobrenadante con una jeringa estéril conectada a filtros de poros de membrana de 0,2 μm y congele a -80 ° C.
nota: Use una jeringa de insulina (u-40) para la aspiración de líquido folicular.
- Asegúrese de seleccionar solo folículos sanos de tamaño mediano (4-6 mm de diámetro) para el aislamiento de AOC.
nota: Los AOC de grado I, que poseen un ovocito intacto y redondo con ooplasma homogéneo y cúmulos compactos de varias capas (al menos 3-4) se consideran adecuados para el procedimiento posterior de IVM en 3D.
- Para aislar los AOC, transfiera 2-3 ovarios a una placa de Petri estéril de 10 cm de diámetro llena de HM. Aísle los AOC de folículos de tamaño mediano siguiendo uno de los siguientes procedimientos.
- Corte suavemente la superficie de los folículos ováricos que sobresalen con una cuchilla quirúrgica estéril 15C. Esto hará que el líquido folicular junto con los AOC fluyan hacia la placa de Petri.
- Aspire el contenido folicular con una aguja de 28 G con un tamaño de 5/8" unida a una jeringa desechable y transfiérala a la placa de Petri.
nota: Deseche los restos de tejido ovárico. Las etapas posteriores de aislamiento se llevan a cabo bajo un microscopio estereoscópico.
- Prepare de 3 a 5 placas de Petri de FIV de 60 mm.
- Añadir 1 mL de HM a los pocillos centrales y colocar 3-4 gotas de HM (50 μL por gota) en sus anillos exteriores.
- A continuación, con una micropipeta de policarbonato, mueva los AOC no dañados a gotas de HM en los anillos exteriores para enjuagarlos brevemente 3-4 veces.
- Al final, transfiéralos individualmente al pozo central. Guarde estas placas de FIV en una incubadora para procedimientos posteriores.