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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Encapsulación en microbiorreactores de etileno propileno fluorado (FEP) superhidrófobos.
NOTA: Asegúrese de que todos los procedimientos de maduración in vitro (IVM) se lleven a cabo en una mesa controlada termostáticamente, y que los complejos cúmulo-ovocito (COC) se mantengan a 38 °C durante toda su manipulación.
- Prepare una placa de Petri de 30 mm que contenga 5 g de lecho de polvo FEP con un tamaño de partícula promedio de 1 μm
NOTA: Es importante utilizar polvo fresco de FEP. El FEP reutilizado tiende a agregarse y formar grumos.
- Distribuya una sola gota de medio de maduración (MM) (~30 μL en volumen) que contenga 3-5 COC sobre el lecho del polvo FEP. Gire la placa suavemente con un movimiento circular para asegurarse de que estas partículas cubran completamente la superficie de la gota líquida y se formen canicas líquidas (LM).
- Recoja LM formado con una pipeta con una punta de 1.000 μL.
NOTA: Corte la punta de la pipeta en el borde para adaptarla al diámetro del LM (4-5 mm). El diámetro aproximado de una punta preparada de este tipo debe ser ligeramente mayor que el del LM.
- Preparar varias placas de Petri de fecundación in vitro (FIV) de 60 mm. Agregue 3-4 mL de agua estéril a los anillos exteriores para preparar la cámara de humedad. A continuación, coloque un LM en el pozo central.
NOTA: Este procedimiento requiere buenas habilidades manuales y precisión: si el mármol se coloca descuidadamente o cae incluso desde una altura baja, se destruirá.
- Incubar canicas durante 4 días a 38 °C en una incubadora con 5% deCO2.
- Cambie el medio diariamente siguiendo el procedimiento: aplique 30 μL de MM en cada LM, lo que provocará su propagación porque el contacto directo con el líquido interrumpe la hidrofobicidad de los polvos FEP recubiertos. Cuando el contenido de mármol se disuelve, transfiera los COC liberados por el biorreactor a una gota de MM fresco en la placa de Petri.
NOTA: Para transferir con precisión los AOC liberados, utilice una micropipeta de policarbonato.
- Después de varios lavados en MM (3-4 veces) para eliminar las partículas de FEP, transfiéralas con 30 μL de MM fresco al lecho de polvo de FEP. Gire suavemente la placa con un movimiento circular para asegurarse de que las partículas de polvo cubran completamente la superficie de la gota líquida y formen un nuevo LM.
- Recoja el LM formado con una pipeta con una punta de 1.000 μL.
- Agregue 3-4 mL de agua estéril a los anillos exteriores para preparar la cámara de humedad. A continuación, coloque un LM en el pocillo central de la placa de Petri de FIV.
NOTA: El recubrimiento transparente del polvo FEP permite controlar el contenido de LM utilizando un microscopio óptico.