Ablación selectiva asistida por láser de células endoteliales corneales porcinas: una técnica para inducir lesiones endoteliales corneales porcinas focalizadas para estudios ex vivo

En este artículo

Resumen

Fuente: Holzhey, A. et al., Desarrollo de un modelo experimental no invasivo asistido por láser de la pérdida de células endoteliales corneales. J. Vis. Exp. (2020)

Este video muestra un procedimiento no invasivo asistido por láser para dañar selectivamente las células endoteliales de la córnea en el ojo porcino. El modelo ex vivo desarrollado de daño celular endotelial se puede utilizar para estudiar enfermedades del endotelio corneal.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Preparación de cultivo de órganos y tratamiento con láser

Obtenga ojos porcinos recién enucleados del matadero local. Manténgalos frescos (4 °C) en el medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con alto contenido de glucosa, suplementado con L-glutamina, piruvato de sodio, penicilina/estreptomicina (1%) y suero porcino (10%), en lo sucesivo denominado en este artículo como medio completo.
Retire los tejidos extracelulares con unas tijeras y remoje los ojos en una solución oftálmica de povidona yodada al 5% durante 5 minutos antes de colocarlos en solución salina esterilizada con tamponado con fosfato (PBS) hasta su uso.
Examinar los ojos para detectar patologías importantes del segmento anterior, como cicatrices corneales, edemas y otras opacidades con un dispositivo de tomografía de coherencia óptica de dominio espectral (Tabla de materiales).
Coloque los ojos frente a una unidad de lámpara de hendidura equipada con un láser Nd:YAG (Tabla de Materiales), que tiene una longitud de onda de 1.064 nm y un diámetro de punto focal de 10 μm en el aire.
nota: Para un posicionamiento óptimo se utiliza un aparato de sujeción impreso en 3D, que fue diseñado para mantener el ojo firme, sin ejercer demasiada presión sobre él (Figura 1).
Utilice un aumento de 12x y desvíe la iluminación para visualizar las capas córneas individuales.
Ajuste la energía del pulso (p. ej., 1,6 mJ) y el punto de enfoque (p. ej., 0,16 mm) para la ablación selectiva de las células endoteliales.
Colocar una paracentesis de córnea transparente cerca del limbo e inyectar viscoelástica (Tabla de Materiales) para estabilizar la cámara anterior.
Extirpar la córnea central tratada con láser con una trépano de 8 mm.
Coloque la córnea extirpada en un pocillo de una placa de 12 pocillos con el sitio endotelial hacia arriba e incube la muestra en 3 mL de medio completo a 37 °C durante un máximo de 3 días.
nota: Durante este paso, se pueden agregar agentes citoprotectores potenciales al medio.

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Resultados

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Figura 1: Configuración experimental.(A) Los ojos se fijaron en un aparato de sujeción parcialmente impreso en 3D, lo que permitió una alineación precisa con respecto al rayo láser. (B) Antes del tratamiento con láser, el tejido se evaluó con un dispositivo de tomografía de coherencia óptica del segmento anterior para detectar patologías importantes del segmento ante...