Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Animales y vivienda
- Adquiere conejos blancos de Nueva Zelanda (NZW) que pesen 2-3 kg.
- Aloje a los conejos individualmente en jaulas con un estricto control de temperatura (65 ± 5 ° F) y humedad (45 ± 5%). La iluminación debe tener un ciclo de encendido/apagado de 12 h.
- Proporciona acceso ilimitado al agua y a la comida estándar para conejos. Elimina los enriquecimientos dietéticos, ya que pueden contener vitamina A que afecta al ojo.
- Aclimatar a los animales durante al menos 2 semanas antes de las mediciones iniciales o de la inducción del ojo seco.
2. Métodos de anestesia y eutanasia
NOTA: Todos los procedimientos requieren una sedación leve, excepto la inyección de Con A que requiere una sedación moderada.
- Para una sedación leve, inyecte acepromazina (1 mg/kg) por vía subcutánea sobre los hombros con una aguja de calibre 26. Criterio de valoración de la sedación leve: los animales mantienen una posición relajada de la cabeza con los lóbulos de las orejas que ya no están completamente erguidos.
nota: Si no se alcanza el criterio de valoración adecuado, se puede administrar una inyección adicional de acepromazina. Los animales siempre deben permanecer despiertos, respondiendo al tacto de sus bigotes, y nunca mostrar una respiración lenta.
- Para una sedación moderada, primero administre a los animales acepromazina como se indicó anteriormente. Una vez alcanzado el criterio de valoración (véase la nota anterior), administre isoflurano utilizando una máscara de gas con un caudal de O2 establecido en 1 L/min y una administración de isoflurano al 5% (Figura 1).
- Administre isoflurano hasta que el tono corporal del conejo esté completamente relajado y las orejas completamente caídas.
nota: No deben producirse movimientos musculares compensatorios cuando el animal esté volteado de lado; La respiración siempre es espontánea.
- La recuperación espontánea se produce en 2-5 minutos: los signos incluyen movimientos espontáneos de la cabeza y aumento o tono muscular normal. Después de completar el procedimiento experimental con sedación moderada, observe a los conejos durante unos 30 minutos o hasta que su comportamiento vuelva a la normalidad.
nota: No se requiere ungüento oftálmico durante ninguna de las formas de sedación. 1) En una sedación leve, los animales siguen alerta y mantienen un reflejo de parpadeo. En la sedación moderada, la inhibición del reflejo de parpadeo es tan corta que la superficie ocular no corre peligro. 2) La colocación de ungüento oftálmico en la superficie ocular impide la visualización de las estructuras evaluadas durante las pruebas.
- Eutanasia: Utilizar una sobredosis de pentobarbital intravenoso (100 mg/kg).
3. Inducción y tratamiento del ojo seco
NOTA: Se inyectan tres porciones del sistema de glándulas lagrimales orbitarias.
- Sedar a los conejos con acepromazina 0,2 mg/kg por vía subcutánea.
- Corta el pelaje en la zona periorbital y del cuero cabelludo y elimina por completo cualquier resto de pelo con Nair. Deje la piel completamente lisa para una mejor visualización de las características anatómicas y la inyección de concanavalina A guiada por ecografía (Figura 2).
- Inducir una sedación moderada como se ha descrito anteriormente.
- Inyección de la porción palpebral de la glándula lagrimal superior (PSLG)
nota: Primero realice la inyección de PSLG.
- Aplicar en el ojo adecuado 25 μL de lidocaína sin conservantes al 1% con una micropipeta.
- Evalúe el párpado superior y aplique una suave presión medial en el reborde orbitario posterior hasta que se vea la protuberancia que marca la porción palpebral de la glándula. El PSLG aparece como una pequeña elevación bulbosa en la porción posterior (temporal) del párpado superior.
nota: Para ver el tejido de la glándula durante el proceso de aprendizaje, aplique fluoresceína al 5% en el área (Figura 3A). Se pueden ver lágrimas brotando del bulboso PSLG. No es necesaria la aplicación de fluoresceína para la administración de Con A; Se hace solo con fines ilustrativos para mostrar el tejido de la glándula.
- Usando pinzas de dientes finos y una aguja de calibre 27 en una jeringa de tuberculina, penetre directamente en la glándula usando un abordaje transconjuntival. Avance la aguja 2 mm en el tejido e inyecte 500 μg de Con A en un volumen de 0,1 mL (Figura 3B).
NOTA: Esta inyección a veces puede ser dolorosa. Si es necesario, mantenga a los animales bajo isoflurano hasta que se complete esta inyección.
