Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Aislamiento de células endoteliales aórticas porcinas
- En condiciones asépticas, retire la aorta de cerdo del tampón de lavado y colóquela en una placa de Petri de 150 mm (Figura 1A).
- Cortar suavemente los dos extremos de la aorta y extirpar el exceso de tejido alrededor de la aorta con pinzas estériles y tijeras de nuevo (Figura 1B). Lave el exterior y el interior de la aorta (sobre la placa de cultivo a temperatura ambiente) con 20-50 mL de tampón de lavado: 1x solución de PBS (pH 7,4) con 1% (v/v) de penicilina/estreptomicina.
nota: Trate de cortar solo el área donde se colocaron las pinzas durante la cirugía, ya que algunas CE se dañaron en esta área, y elimine el exceso de tejidos y ramas laterales arteriales.
- Pase una sutura quirúrgica a través de la aorta y luego ate un extremo de la aorta usando la sutura quirúrgica (5-0, 90 cm, Tabla de Materiales). Mantenga la sutura quirúrgica en el interior de la aorta (Figura 1C,D).
- Fije suavemente la aorta cerca del extremo atado con fórceps y luego tire lentamente de la sutura quirúrgica para revertir la aorta hasta que la superficie endotelial de la aorta quede expuesta (Figura 1E-G)
nota: Asegúrese de fijar la aorta cerca del extremo atado y no fije la aorta con fuerza, o de lo contrario, la aorta no se puede revertir tirando de la sutura quirúrgica.
- Lave la superficie endotelial de la aorta con tampón de lavado 3 veces (10 ml por lavado) y luego deseche esta solución. Coloque la aorta en un tubo centrífugo de 15 mL y cubra la aorta con 10 mL de solución digestiva de colagenasa IV al 0,005% en el tubo (Figura 1H).
nota: Precalentar la solución digestiva de colagenasa IV al 0,005% a 37 °C antes de la digestión.
- Incubar a 37 °C durante 15 min. Colocar la aorta digerida y la solución digestiva en una placa de cultivo de 100 mm y detener los efectos de la colagenasa IV al 0,005% añadiendo 10-15 mL de tampón de parada preenfriado: Medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con un 10% de FBS inactivado por calor y un 1% de P/S.
nota: El tiempo de digestión recomendado es de entre 10 y 20 minutos. Asegúrese de que la superficie endotelial de la aorta esté cubierta por el tampón de tope.
- Raspe suavemente las pAEC de la superficie interna de la aorta con un raspador de células (Figura 1I). Lave la aorta raspada 3 veces con tampón de lavado (5 mL por vez). Coloque la solución de la placa de cultivo en un tubo de centrífuga de 50 ml. Lave el fondo de la placa de cultivo 2 veces con tampón de lavado (5 mL por vez) y vuelva a colocar la solución en un tubo de centrífuga de 50 mL.
nota: Raspe en una dirección suavemente y no comprima. No toque el pañuelo cerca de los bordes y los agujeros. Se recomienda raspar de 5 a 8 veces.
- Centrifugar el tubo a 600 x g durante 6 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y deje 10 mL de solución en el fondo de un tubo de centrífuga de 50 mL. Agregue 20 ml de tampón de lavado al tubo de centrífuga de 50 ml y vuelva a suspender los pellets. Evite las burbujas durante este paso.
- Centrifugar a 600 x g durante 6 min a 4 °C. Deseche lentamente el sobrenadante. Vuelva a suspender los gránulos celulares con 1 mL de medio de cultivo y mezcle bien.
nota: El número medio de CE por cm de aorta es de 1,9 x 10⁵ ± 1,4 x 10⁴ (media ± DE, n = 3).
- Cuente las celdas con un contador de celdas. Coloque y cultive las células en un recipiente sin recubrir ningún material de acuerdo con el número de células. Si el número de células es menor o igual que 1,0 x 10⁶, cultive las células en un matraz de 25 cm². Si el número de células es superior a 1,0 x 10⁶, cultive las células en varios matraces de 25 cm² (1,0 x 10⁶ células por matraz). Coloque el matraz en una incubadora (sin agitar) a 37 °C con 5% de CO₂ y reemplace el medio cada 2-3 días.
nota: Algunas células son dañadas por el raspador de células. Un ensayo de viabilidad celular encontró que el porcentaje de células vivas era del 95,7% ± 1,7% (media ± DE, n = 3). El tiempo de duplicación de las células aisladas es de aproximadamente 1-2 días.
