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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Aislamiento de las arterias ciliares posteriores cortas
Los ojos porcinos junto con el nervio óptico y los tejidos extraoculares se obtuvieron inmediatamente post-mortem. Los ojos enucleados se transportaron al laboratorio en solución salina tamponada con fosfato (PBS) helada y se utilizaron inmediatamente.
NOTA: El ojo porcino se divide básicamente en las secciones anterior (Figura 1A) y posterior (Figura 1B).
- Coloque el globo ocular en una cámara de disección que contenga tampón Krebs-Henseleit (K-H) helado. Corta con cuidado los músculos y tejidos circundantes con unas tijeras afiladas de Mayo.
nota: Para preparar el tampón Krebs-Henseleit (K-H), pese los siguientes productos químicos (27,68 g de NaCl, 8,4 g de NaHCO, 3,1,4 g de KCl, 1,18 g de MgSO4 y 0,64 g de KH2PO4) en un tubo de centrífuga cónico seco y limpio de 50 ml y 1,47 g de CaCl2 y 8,0 g de glucosa en otro tubo. La mezcla en polvo de estos productos químicos debe almacenarse en un lugar fresco y seco. La mezcla de CaCl2 y glucosa en polvo se prepara mejor fresca para evitar la absorción de humedad y la formación de grumos.
- Haga una incisión con un bisturí y corte el globo a lo largo del plano ecuatorial con unas tijeras Mayo afiladas hasta que el ojo quede separado en las mitades anterior y posterior. Extraiga la mayor cantidad posible de cuerpo vítreo de la mitad posterior del ojo con un par de pinzas de patrón estándar.
nota: La separación del globo ocular en dos mitades facilita el aislamiento de las arterias ciliares posteriores cortas (PCCs) con facilidad sin tener un ojo en movimiento en la placa de disección. Sin embargo, este paso no es obligatorio. Los vasos también se pueden aislar sin abrir el globo ocular.
- Use alfileres de disección para sujetar cuidadosamente la mitad posterior del ojo con el lado de la retina hacia abajo y el nervio óptico hacia arriba, hacia el experimentador.
- Corta suavemente los tejidos conectivos que rodean el nervio óptico para exponer la vasculatura retrobulbar subyacente con un par de tijeras de resorte Student Vannas.
- El sPCA se puede ver como ramas cortas de vasos (entre 5-8 ramas) que penetran en la esclerótica y rodean circunferencialmente la cabeza del nervio óptico (Figura 1C). Aísle el sPCA paraóptico y distal junto con los tejidos conectivos circundantes con un par de pinzas de precisión tipo 5 y tijeras de capsulotomía Vannas (Figura 1D).
nota: Asegúrese de que el tampón K-H permanezca helado durante todo el procedimiento de aislamiento. Se recomienda encarecidamente cambiar el tampón cada 20-30 min, dependiendo de la temperatura ambiente.
2. Preparación de la muestra
- Retire suavemente los tejidos conectivos de los segmentos arteriales con pinzas de precisión tipo 5 de punta extra fina y tijeras de capsulotomía Vannas bajo un microscopio estereoscópico y enjuague las arterias aisladas con PBS helado para eliminar los contaminantes y los residuos de sangre.
nota: Si las muestras no se someten inmediatamente a los siguientes pasos, congélelas en nitrógeno líquido y guárdelas a -80 °C hasta su uso posterior.
