Vitrificación de embriones de conejo con paja criogénica: una técnica de enfriamiento ultrarrápido para preservar embriones de conejo para su almacenamiento a largo plazo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Vitrificación embrionaria

1. Realice todas las manipulaciones a temperatura ambiente (alrededor de 22 °C) para reducir la toxicidad de la solución de vitrificación a temperaturas más cálidas.
   nota: Los embriones se pueden mover utilizando una pipeta automática de 0,1-2 μL en este protocolo, pero pueden ser adecuados otros dispositivos similares para mover los embriones arrastrando el volumen mínimo.
2. Vitrificar los embriones en un procedimiento de adición de dos pasos:
   1. Colocar los embriones durante 2 minutos en una solución equilibrante compuesta por un 10% (v/v) de etilenglicol y un 10% (v/v) de dimetilsulfóxido disuelto en medio base (BM). (Composición de BM: solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco suplementada con 0,2% (p/v) de albúmina sérica bovina)
   2. Mover los embriones (desde el paso 1.2.1) durante 1 minuto a una solución de vitrificación que consiste en un 20% (v/v) de etilenglicol y un 20% (v/v) de dimetilsulfóxido disuelto en BM.
3. Cargue los embriones en una pajita de plástico de 0,25 ml (que contiene un extremo cerrado con un tapón de algodón y un extremo abierto). El proceso se esquematiza en la Figura 1.
   1. Acople el extremo cerrado de 0,25 ml de ministraw con el microdosificador adecuado (por ejemplo, Captroll III).®
   2. Aspirar BM hasta 1/3 de la longitud de la pajita, seguido de una pequeña burbuja de aire.
   3. Aspirar los embriones en un volumen de 40 μL de solución de vitrificación, seguido de otra pequeña burbuja de aire.
   4. Aspirar BM hasta que la primera fracción líquida (paso 1.3.2) llegue al algodón.
   5. Cierre el extremo abierto con un tapón de pajita.
4. Realice el paso 1.2.2 mientras se realiza el paso 1.3 para asegurarse de que no transcurra más de un minuto, lo que sería tóxico para los embriones.
5. Sumerja la ministraw directamente en nitrógeno líquido para lograr la vitrificación.
6. Guarde la minipaja en un dewar para nitrógeno durante el tiempo deseado.

Figura 1: Esquematización de la paja correctamente cargada. A) BM se refiere a los medios de manipulación embrionaria empleados durante la vitrificación. Los embriones deben cargarse en solución de vitrificación. B) Aspecto macroscópico de la pajuela cargada con un detalle magnificado de la posición del embrión. Este dispositivo de gran volumen nos permite vitrificar un gran número de embriones, a diferencia de los dispositivos de volumen mínimo. Además, el manejo de este dispositivo es más fácil en comparación con los dispositivos de volumen mínimo.