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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Vitrificación embrionaria
- Realice todas las manipulaciones a temperatura ambiente (alrededor de 22 °C) para reducir la toxicidad de la solución de vitrificación a temperaturas más cálidas.
nota: Los embriones se pueden mover utilizando una pipeta automática de 0,1-2 μL en este protocolo, pero pueden ser adecuados otros dispositivos similares para mover los embriones arrastrando el volumen mínimo.
- Vitrificar los embriones en un procedimiento de adición de dos pasos:
- Colocar los embriones durante 2 minutos en una solución equilibrante compuesta por un 10% (v/v) de etilenglicol y un 10% (v/v) de dimetilsulfóxido disuelto en medio base (BM). (Composición de BM: solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco suplementada con 0,2% (p/v) de albúmina sérica bovina)
- Mover los embriones (desde el paso 1.2.1) durante 1 minuto a una solución de vitrificación que consiste en un 20% (v/v) de etilenglicol y un 20% (v/v) de dimetilsulfóxido disuelto en BM.
- Cargue los embriones en una pajita de plástico de 0,25 ml (que contiene un extremo cerrado con un tapón de algodón y un extremo abierto). El proceso se esquematiza en la Figura 1.
- Acople el extremo cerrado de 0,25 ml de ministraw con el microdosificador adecuado (por ejemplo, Captroll III).®
- Aspirar BM hasta 1/3 de la longitud de la pajita, seguido de una pequeña burbuja de aire.
- Aspirar los embriones en un volumen de 40 μL de solución de vitrificación, seguido de otra pequeña burbuja de aire.
- Aspirar BM hasta que la primera fracción líquida (paso 1.3.2) llegue al algodón.
- Cierre el extremo abierto con un tapón de pajita.
- Realice el paso 1.2.2 mientras se realiza el paso 1.3 para asegurarse de que no transcurra más de un minuto, lo que sería tóxico para los embriones.
- Sumerja la ministraw directamente en nitrógeno líquido para lograr la vitrificación.
- Guarde la minipaja en un dewar para nitrógeno durante el tiempo deseado.
