Transferencia de embriones a conejo: un procedimiento para la transferencia guiada por laparoscopia de embriones al oviducto de un modelo de coneja receptora ovulante

Resumen

Fuente: García-Domínguez, X. et al., Transferencia embrionaria mínimamente invasiva y vitrificación embrionaria en la etapa embrionaria óptima en un modelo de conejo. J. Vis. Exp. (2019)

Este video describe la técnica de transferir embriones al oviducto de una coneja receptora mediante laparoscopia. Permite la remodelación embrionaria en conejos durante su migración a través del oviducto, lo que finalmente ayuda a una implantación exitosa. Esta técnica también se puede utilizar para embriones almacenados con buena eficiencia.

Protocolo

1. Transferencia de embriones

1. Preparación de las hembras receptoras
   1. Use solo hembras sexualmente maduras (> 4.5 meses de edad).
   2. Una semana antes de ET, adapte a las hembras a un régimen de 16 h de luz/8 h de oscuridad para iniciar el crecimiento folicular y mejorar la receptividad femenina.
   3. Seleccionar las hembras receptoras, observando la turgencia y el color de la vulva. Si la vulva es turgente y rojiza, la hembra es receptiva.
   4. Inducir un pseudoembarazo (ovulación) mediante una única inyección intramuscular de 1 μg de acetato de buserelina (análogo sintético de la hormona liberadora de gonadotropina) independientemente del peso corporal
      NOTA: Normalmente, 0,8 μg es una dosis adecuada para la inducción de la ovulación en conejos de tamaño mediano (4-5 kg), por lo que 1 μg generalmente garantiza la ovulación.
   5. Inducir la ovulación tantos días antes como la edad de los embriones a transferir (por ejemplo, 70-72 h antes de la mórula fresca ET).
2. Anestesia y analgesia
   1. Pesar al conejo y cargar los siguientes anestésicos y analgésicos.
      1. En una jeringa de 1 mL con aguja de 30 G: cargue xilacina (5 mg/kg) y clorhidrato de buprenorfina (0,03 mg/kg). En otra jeringa de 1 mL con aguja pericraneal de 23 G, cargue clorhidrato de ketamina (35 mg/kg).
   2. Sostenga el conejo e inyecte la mezcla de xilacina y buprenorfina por vía intramuscular.
   3. Insertar la aguja pericraneal con ketamina en la vena marginal del oído, introduciendo lentamente todo el contenido de la jeringa por vía intravenosa.
   4. Fije la aguja y déjela insertada a lo largo de los pasos restantes para administrar más anestesia si es necesario.
   5. Deje al conejo en la jaula (limpia y sin ningún otro animal) en un escenario cálido.
   6. Una vez inconsciente, aplique ungüento ocular para evitar la sequedad del ojo y comprobar la ausencia del reflejo palpebral.
      nota: Este protocolo proporciona un plano de anestesia quirúrgica durante un mínimo de 30 min. Si se requiere un tiempo más largo, inyecte dosis adicionales con la mitad de la cantidad de clorhidrato de ketamina descrita en 1.2.1 después de 30 min.
   7. Controle la profundidad de la anestesia comprobando el reflejo del pedal y el movimiento de la respiración. Los cambios en el patrón de respiración a un ritmo irregular y más rápido indican la pérdida del plano adecuado de anestesia.
   8. Controle el color de las membranas mucosas (ojos, labios, etc.), la frecuencia respiratoria (30-60 respiraciones por minuto), la frecuencia cardíaca (120-325 latidos por minuto) y la temperatura rectal (38-39,6 °C).
   9. Ocho horas antes de la transferencia, retenga la comida de los animales para evitar el mayor tamaño del intestino y la actividad hasta que finalice el proceso de ET. Dejar libre acceso al agua.
3. Preparación embrionaria
   1. Calentar el medio de manipulación embrionaria a 25 °C: Medio base (BM), compuesto por solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco suplementada con 0,2% (p/v) de albúmina sérica bovina.
   2. Trabajando bajo un microscopio estereoscópico, enjuague los embriones frescos o descongelados (Paso 2) con BM.
   3. Con guantes estériles, conecte un catéter epidural de 17G configurado adecuadamente a una jeringa de 1 ml.
   4. Aspire 1 cm de BM en el catéter, seguido de una pequeña burbuja de aire.
   5. Aspirar 5-7 embriones en un volumen de 10 μL de BM, seguido de otra pequeña burbuja de aire.
   6. Termine de cargar el catéter aspirando 1 cm de BM.
4. transferencia de embriones
   1. Considere el uso de guantes, batas y mascarillas estériles para garantizar un entorno aséptico.
   2. Esterilice los instrumentos quirúrgicos, limpie las superficies donde se realizará la cirugía y límpielas con etanol al 70%.
   3. Realizar la anestesia como se ha detallado anteriormente (paso 1.2), comprobando si hay pérdida de reflejos.
   4. Afeita el pelaje del abdomen ventral con una maquinilla de afeitar eléctrica.
   5. Preparar el abdomen ventral asépticamente.
      1. Limpie el área quirúrgica y elimine el vello restante. Lave el área quirúrgica con un jabón de gluconato de clorhexidina. Higienizar la zona con solución de clorhexidina y etanol 96º (3 veces).
   6. Coloque al animal en una mesa quirúrgica caliente, en la posición de Trendelenburg (con la cabeza hacia abajo a 45°) para asegurarse de que el estómago y los intestinos estén ubicados cranealmente. Considere la evacuación de la vejiga si está turgente. Si alguna víscera se daña en el proceso, el animal puede morir. Por lo tanto, es importante tenerlos correctamente ubicados (Figura 1).
   7. Cubra el área con una toalla estéril, con un orificio (fenestración) que exponga el área afeitada, para separar el sitio quirúrgico de cualquier área potencialmente contaminante.
   8. Insertar un trocar endoscópico de 5 cm en la cavidad abdominal, caudal de 2 cm a la apófisis xifoides, e insuflar a través de él la cavidad peritoneal con un insuflador mecánico regulador >nota: La presión intraabdominal debe ser de 8-12 mmHg con CO₂ (Figura 1A).
   9. Inserte la cámara endoscópica a través del trócar endoscópico (Figura 1B).
      NOTA: Identificar el tracto reproductivo, determinando el estado y la posición del infundíbulo y la ampolla antes de la ET para facilitar los siguientes pasos.
   10. Insertar la aguja epidural de 17-G en la región inguinal entre 2-3 cm del infundíbulo (Figura 1B).
   11. Identifique la entrada del infundíbulo (Figura 2A, 2B).
   12. Inserte el catéter cargado (paso 1.3) a través de la aguja epidural hasta el abdomen (Figura 1C).
   13. Localizar el oviducto e introducir 1-2 cm del catéter epidural a través del infundíbulo en la ampolla (Figura 2A-2C). No avance mucho en el oviducto para evitar daños y hemorragias.
   14. Libere los embriones en el oviducto presionando suavemente el émbolo de la jeringa acoplada al catéter (Figura 2D-2F). Ambas burbujas de aire deben salir del catéter.
   15. Retire el catéter justo después de que se hayan liberado los embriones.
   16. Enjuagar el catéter, aspirar y liberar el medio manipulador para comprobar la ausencia de los embriones y confirmar su correcta transferencia.
   17. Repita los pasos 1.4.11 a 1.4.16 en el otro lado del útero, si lo desea.
   18. Retire la aguja epidural y la cámara endoscópica.
   19. Libera CO₂ a través del trócar endoscópico. Si queda exceso de gas en el abdomen del animal, tendrá dolor y molestias.
   20. Retire el trócar endoscópico de la cavidad abdominal. Retire la toalla quirúrgica.
   21. Suspenda la anestesia.
   22. Limpie la incisión hecha por el trócar con una solución de clorhexidina. Cierre la incisión realizada por el trócar con un aluminio micronizado y un apósito de plástico.

Resultados

Figura 1: Transferencia embrionaria laparoscópica asistida por laparoscopia (Vista externa).A) Inserción del trócar endoscópico (un puerto). B) Inserción de la cámara endoscópica y la aguja epidural (flecha negra). C) Inserción del catéter de transferencia embrionaria (flecha blanca) a través de la aguja epidural.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Albúmina sérica bovina (BSA)	VWR	Artículo 332
Clorhidrato de buprenorfina	Alvet Escartí	626	A ser ordenado por un veterinario autorizado.
Acetato de buselina	Sigma Aldrich	B3303
CO2	Air Liquide	99921	CO2 N48.
Solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco	Sigma Aldrich	D5773	Sin cloruro de calcio
máquina de afeitar	Oster Golden A5	078005-140-002
Cámara endoscópica	Optomic España S.A	OP-714
Trocar endoscópico con válvula de silicona	Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A.	30114GK	Modelo de trocar ligero.
Jabón de digluconato de clorhexidina	Alvet Escartí	0265DCCJ500B
Aguja epicraneal 23G	Alvet Escartí	514056353	También se pueden utilizar agujas más pequeñas.
Catéter epidural	Vygon corporativo	Artículo 187.1
Aguja epidural	Vygon corporativo	Artículo 187.1
Ungüento para los ojos	Alvet Escartí	5273
Equipo de laparoscopia	Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A.	26003 AA	® Laparoscopio Hopkins, laparoscopio de visión recta de 0º mm, 30 cm de longitud, canal de trabajo de 5 mm.
Fuente de luz	Optomic España S.A	Fibrolux 250
Insuflador mecánico de CO2	Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A.	Endoflator®
Tubo de silicona para insufflato	r Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A.	20400040
Microscopio estereoscópico	Leica	MZ16F	Hay opciones más baratas como la Leica MZ8 o la Nikon SMZ-10 o la SMZ-2B, por nombrar algunas.
Conejos	Universitat Politècnica de València	Línea A	Se pueden utilizar otras líneas maternas, como la Línea V o la Línea HP.