Carga de perlas para introducir ácidos nucleicos en células cultivadas adherentes: una técnica para cargar plásmidos fluorescentes que codifican proteínas en células de mamíferos adherentes

Resumen

Fuente: Cialek, C. A. et al. Proteínas de carga de perlas y ácidos nucleicos en células humanas adherentes. J. Vis. Exp. (2021).

En este video, describimos el procedimiento para introducir ácidos nucleicos en células de mamíferos adherentes utilizando la carga de cuentas.

Protocolo

1. Células de carga de cordón

NOTA: Si es necesario, lave brevemente las células con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y luego agregue 2 mL del medio óptimo. Incubar durante al menos 30 min.

1. Prepare una solución de 3-8 μL que contenga los plásmidos, proteínas y/o partículas deseados. Utilice ~1 μg (0,1-1 pmol) de cada tipo de plásmido y ~0,5 μg (0,01 nmol) de proteína, dependiendo de los requisitos experimentales. Utilice un tubo de baja retención para las proteínas para que no se queden en las paredes del tubo. Lleve la solución a un mínimo de 3 μL con PBS y ajuste el volumen de la solución para cubrir toda el área de celdas que se van a cargar (es decir, el micropocillo de la cámara, Figura 1B).
2. Mezcle bien la solución pipeteando hacia arriba y hacia abajo y/o moviendo el tubo. Gira brevemente la solución hasta el fondo del tubo en un microfugo de mesa.
3. Transfiera la solución de carga de perlas y la cámara de células a una campana de cultivo de tejidos. Realice los pasos restantes en la campana de cultivo de tejidos utilizando una técnica estéril.
4. Retire el medio de las células y guárdelo temporalmente en un tubo estéril. Aspire suavemente todo el medio alrededor de los bordes de la cámara e incline la cámara en un ángulo de aproximadamente 45° y elimine la gota restante de medio en el micropocillo central. Durante la extracción del medio, asegúrese de evitar que la punta de la pipeta toque el vidrio, lo que puede provocar la descamación y la pérdida de células. Pase rápidamente al siguiente paso para que las células no estén secas por mucho tiempo.
5. Pipetee suavemente la solución de carga de perlas en el micropocillo de vidrio en el centro de la cámara. Opcional: Incubar con un balanceo suave durante ~30 s sin permitir que la cámara se seque por completo.
6. Disperse suavemente una monocapa de perlas de vidrio en la parte superior de las celdas, preferiblemente utilizando un aparato de carga de perlas (Figura 1A). Asegúrese de que las perlas cubran completamente las células del micropocillo con fondo de vidrio.
7. Pellizcando la cámara con dos dedos, golpéela contra la superficie del capó levantándola ~ 2 pulgadas y bajándola firmemente. Use una fuerza aproximadamente equivalente a dejar caer el plato desde esa altura. Repita para un total de ~ 10 toques.
   nota: Asegúrese de que los grifos no despeguen sustancialmente las celdas. El roscado se puede optimizar para el tipo de célula. Si las celdas se cargan mal, golpee más fuerte; Sin embargo, si muchas celdas se despegan, golpee más ligeramente.
8. Agregue suavemente el medio a la cámara pipeteando lentamente en el lado de plástico de la cámara. Trate de aspirar las cuentas flotantes sin alterar las células. Agregue más medios precalentados en este paso si se eliminó demasiado. Incubar las células durante 0,5-2 h en la incubadora.

Resultados

Figura 1: Aparato de carga de cuentas, técnica y línea de tiempo

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placas de cultivo celular de 10 cm	VWR	82050-916	Uso para cultivar células
Placas de cultivo celular de 35 mm	halcón	353001	Úselo para construir un cargador de cuentas
Cámara de celda Attofluor	Thermo Fisher Scientific	A7816	Úselo para construir el cargador de cuentas personalizado
DMEM, alto contenido de glucosa, sin glutamina	Thermo Fisher Scientific	11960069	Uso en cultivos celulares generales
Platos con fondo de vidrio, 35 mm, #1.5, vidrio de 14 mm	Corporación MatTek	P35G-1.5-14-C	Células de siembra en estas cámaras para la obtención de imágenes
Perlas de vidrio, lavadas con ácido, ≤106 μm	Millipore Sigma	G4649	Espolvorea sobre las células para cargar el ADN plasmídico y las proteínas
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Thermo Fisher Scientific	AM9625	Existencias de trabajo de PBS estériles 1X
DMEM sin fenol	Thermo Fisher Scientific	31053036	Uso en células antes de la obtención de imágenes
Opti-MEM, Suero Reducido Medio	Thermo Fisher Scientific	31985070	Medios óptimos para incubar células antes de la carga de cordones (paso opcional)