Liberación de carga de ácido nucleico basada en nanoblades: una técnica para administrar el complejo Cas9-sgRNA a las células objetivo a través de partículas similares a virus

Resumen

Fuente: Mangeot, P. E., et al. Entrega del complejo de ribonucleoproteína Cas9/sgRNA en células inmortalizadas y primarias a través de partículas similares a virus ("nanoblades"). J. Vis. Exp. (2021).

Este video muestra una técnica para la administración basada en nanoblades del complejo de ribonucleoproteínas Cas9-sgRNA dentro de las células objetivo para la edición del genoma. Las nanocuchillas son partículas similares a los virus que carecen de la capacidad de multiplicarse e infectar a las células vecinas, por lo que son muy útiles para el transporte rápido y dependiente de la dosis de biomateriales y nanomateriales.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Diseño y clonación de sgRNA

NOTA: Las directrices para el diseño de sgRNAs pueden obtenerse de múltiples fuentes, como https://blog.addgene.org/how-to-design-your-grna-for-crispr-genome-editing o de Hanna y Doench.

1. Una vez diseñadas las secuencias de 20 nucleótidos de sgRNA, solicite los siguientes oligonucleótidos de ADN monocatenario:
   1. Adelante: 5' caccgNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 3' (N corresponde al locus objetivo sin la secuencia de motivos adyacentes al protoespaciador (PAM))
   2. Reverso: 5' aaacNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN>nota: No se requieren modificaciones especiales al pedir los oligonucleótidos (no se requiere fosfato 5').
2. Hibridar los dos oligonucleótidos de ADN en un tubo de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de 0,2 mL mezclando 5 μL de tampón de recocido (500 mM de NaCl; 100 mM de Tris-HCl; 100 mM de MgCl2; 10 mM de DTT; pH 7,9 a 25 °C), 1 μL de cada oligonucleótido de ADN (100 μM de solución madre en agua) y 42 μL de agua.
3. En un bloque de PCR, incubar las muestras a 95 °C durante 15 s y luego disminuir la temperatura a 20 °C con una rampa de 0,5 °C/s. Mantener a temperatura ambiente o almacenar a -20 °C.
   nota: El protocolo se puede pausar aquí.
4. Digestión de 10 μg de los plásmidos de expresión de sgRNA BLADE o SUPERBLADE con 10 unidades de la enzima de restricción BsmBI-v2 durante 3 h a 55 °C en un volumen total de reacción de 50 μL.
   nota: El vector digerido debe liberar un inserto de ADN de ~1,9 kb y un segundo fragmento de ADN de ~3,3 kb.
5. Cargue la reacción de restricción en un gel de agarosa al 1% teñido con 5 μg/mL de bromuro de etidio (o una tinción de gel de ADN alternativa más segura).
   nota: Use el equipo de protección adecuado cuando manipule bromuro de etidio, que se sospecha que causa defectos genéticos.
   1. En una mesa ultravioleta (UV) colocada a una longitud de onda de 312 nm (para evitar dañar el ADN), corte el fragmento de ADN de 3,3 kb del gel y colóquelo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL><. NOTA: Use el equipo de protección adecuado (guantes y gafas de protección UV) cuando manipule bromuro de etidio y trabaje en la mesa UV.
   2. Extraiga el ADN del gel cortado que contiene el fragmento de ADN de 3,3 kb utilizando un kit de extracción de gel de ADN específico (consulte la tabla de materiales). Cuantifique la cantidad de ADN purificado utilizando un espectrofotómetro.
      NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.
6. Limine los oligonucleótidos de ADN híbridos hacia adelante y hacia atrás del paso 1.2 al vector BLADES o SUPERBLADE digeridos y purificados en gel digeridos por BsmB1 del paso 1.5.2. Para ello, añadir 2 μL de tampón de ADN ligasa T4, 50 ng del vector purificado en gel (del paso 1.5.2), 1 μL de los oligonucleótidos de ADN hibridados (del paso 1.2), agua para completar el volumen a 19 μL y 1 μL de ADN ligasa T4. Incubar la reacción a 25 °C durante 10 min.
   1. Transformar el producto de ligadura en bacterias competentes (ver la Tabla de Materiales). Colocar las bacterias transformadas en una placa de agar Luria Bertani con ampicilina e incubar durante la noche a 37 °C.
   2. Seleccione varias colonias aisladas en la placa de agar para realizar la minipreparación del ADN (consulte la Tabla de Materiales) y realice la secuenciación de Sanger utilizando un cebador directo U6 (5' GACTATCATATGCTTACCGT 3') para verificar la ligadura correcta de la secuencia variable de sgRNA.
      NOTA: Se pueden utilizar otros plásmidos de expresión de sgRNA si no codifican la proteína Cas9, lo que podría interferir con la producción de Nanoblade.

>2. Preparación de plásmidos

1. Realice una maxipreparación (consulte la Tabla de Materiales) de todos los plásmidos requeridos y prepare 10 μg de alícuotas a 1 μg/mL para almacenarlas a -20 °C. Evite los ciclos repetidos de congelación/descongelación de los plásmidos; use alícuotas dos veces antes de desecharlos.

>3. Preparación de la nanocuchilla

1. El día 1, siembre entre 3,5 y 4 × 10⁶ células HEK293T (ver la Tabla de Materiales) en 10 mL del medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) que contiene glucosa alta, piruvato de sodio, L-glutamina, 10% de suero fetal bovino (FBS) y penicilina/estreptomicina en una placa de cultivo celular de 10 cm. Mueva la placa de 10 cm suavemente hacia atrás y hacia adelante, luego de derecha a izquierda (repita esta secuencia 5 veces) para distribuir las células de manera homogénea sobre la placa de cultivo. Incubar las células a 37 °C en una incubadora de células con 5% de CO₂.
   nota: Todos los procedimientos relacionados con la manipulación de células cultivadas y Nanoblades deben realizarse bajo una campana de flujo laminar de cultivo celular para evitar su contaminación.
2. Día 2: Transfección de plásmidos
   1. Las células deben tener una confluente del 70-80% 24 h después de la siembra (Figura 1A). Reemplace el medio con 10 mL de DMEM fresco que contenga glucosa alta, piruvato de sodio, L-glutamina, 10% de FBS (se pueden omitir la penicilina y la estreptomicina, aunque no es obligatorio) antes >NOTA: En este paso, es importante que las células no sean confluentes. De lo contrario, se podría reducir la eficiencia de la transfección, así como la producción de partículas.
   2. Para cada placa de 10 cm, prepare las siguientes cantidades de plásmidos en un tubo de 1,5 ml: 0,3 μg de pCMV-VSV-G, 0,7 μg de pBaEVRless, 2,7 μg de MLV Gag/Pol, 1,7 μg de BIC-Gag-Cas9, 4,4 μg de plásmido BLADES o SUPERBLADES que codifican el sgRNA clonado (o 2,2 μg cada uno si se utilizan dos sgRNAs).
   3. Añadir 500 μL de tampón de transfección (ver la Tabla de Materiales), vórtice durante 10 s y luego centrifugar durante 1 s. Añadir 20 μL del reactivo de transfección (ver la Tabla de Materiales), vortice el tubo durante 1 s y luego centrifugar durante 1 s.
   4. Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente y añadir toda la solución gota a gota a las células en medio DMEM utilizando una pipeta P1000. Mueva suavemente la placa de 10 cm hacia atrás y hacia adelante, luego de derecha a izquierda (repita esta secuencia 5 veces) para distribuir uniformemente el reactivo de transfección sobre las células. Incubar las células a 37 °C durante al menos 40 h en una incubadora de células con 5% de CO₂,
      nota: Si se desea, se puede cambiar el medio 4 h después de la transfección.
3. El día 3, verifique la morfología de las células transfectadas bajo el microscopio.
   nota: Las células productoras comenzarán a fusionarse. Esto es normal debido a la expresión de envolturas virales fusogénicas (Figura 1B,C).
4. Día 4: Cosecha de Nanoblades
   nota: Al menos 40 h después de la transfección, las células se habrían fusionado debido a la expresión de las envolturas virales fusogénicas y, a veces, las células se separan completamente del soporte de la placa (Figura 1D).
   1. Recoja 9 mL del sobrenadante del medio de cultivo utilizando una pipeta de 10 mL.
      nota: Las nanoblades son VLP capaces de administrar la proteína Cas9 y su sgRNA asociado en células primarias e in vivo. Aunque no se consideran organismos genéticamente modificados ya que están desprovistos de material genético, pueden inducir cambios genéticos. Por lo tanto, deben manipularse con precaución para evitar cualquier contacto con los usuarios (especialmente si están programados para dirigirse a genes supresores de tumores). Se aconseja a los usuarios que sigan las directrices de seguridad locales para la manipulación de vectores retrovirales y que trabajen en un laboratorio de nivel BSL-2 cuando preparen VLP y realicen experimentos de transducción. Las nanoblades pueden inactivarse con un 70% de etanol o un 0,5% de hipoclorito de sodio. También es aconsejable tratar todos los residuos plásticos (puntas de pipeta, placas de cultivo de tejidos, tubos de centrifugación) con hipoclorito de sodio al 0,5% durante al menos 10 minutos para inactivar las Nanoblades.
   2. Centrifugar el sobrenadante recolectado a 500 × g durante 5 min para eliminar los desechos celulares y recuperar el sobrenadante sin alterar la pellets celular.
      NOTA: Si los Nanoblades están destinados a ser utilizados en células primarias, filtre el sobrenadante con un filtro de 0,45 μm o 0,8 μm. Tenga en cuenta que este paso reduce drásticamente el título de Nanoblade, ya que una fracción significativa se bloqueará en la membrana del filtro.
   3. Granular las Nanoblades durante la noche (12-16 h) en un rotor de cubo oscilante a 4.300 × g o a 209.490 × g en una ultracentrífuga durante 75 min a 4 °C (ver Tabla de Materiales)
      NOTA: Si las células objetivo pueden crecer en DMEM, es posible incubarlas directamente con el sobrenadante obtenido después del paso 3.4.2 sin concentrar las Nanoblades.
5. Día 5: Resuspensión y almacenamiento de Nanoblades
   1. Después de la centrifugación, aspire lentamente el medio y vuelva a suspender el pellet blanco con 100 μL de solución salina fría 1x tamponada con fosfato (PBS). Cubra el tubo con parafilm e incube durante 1 h a 4 °C con una agitación suave antes de volver a suspender el pellet pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
      nota: Puede aparecer un material viscoso blanco tras la resuspensión; Esto es normal y no afecta significativamente la eficiencia de la transducción.
   2. Guarde los Nanoblades a 4 °C si planea usarlos dentro de cuatro semanas. De lo contrario, congele rápidamente los Nanoblades en nitrógeno líquido y guárdelos a -80 °C.
      NOTA: Use gafas de protección y guantes criogénicos cuando manipule nitrógeno líquido. La congelación instantánea y el almacenamiento a -80 °C conducen a una disminución significativa en la eficiencia de Nanoblade. Además, los Nanoblades descongelados no deben volver a congelarse. El protocolo se puede pausar aquí.

>4. Concentración de Nanoblades en un cojín de sacarosa

NOTA: Como alternativa a la centrifugación nocturna o ultracentrifugación (paso 3.4.3), las Nanoblades se pueden concentrar en una almohadilla de sacarosa. Esto produce una fracción más pura de Nanoblades, aunque la cantidad total recuperada será menor.

1. Prepare una solución de sacarosa al 10% (peso a volumen) en 1x PBS y fíltrela a través de un filtro de jeringa de 0,2 μm (consulte la tabla de materiales).
2. Comience el proceso de concentración de las Nanoblades en la almohadilla de sacarosa.
   1. Coloque 9 mL de muestra que contiene VLP (del paso 3.4.3) en un tubo de ultracentrífuga (consulte la Tabla de materiales). Con una jeringa y una cánula de 3 mL, coloque lentamente 2,5 mL de sacarosa al 10% debajo de la muestra, tratando de no mezclar la muestra que contiene VLP y la solución de sacarosa.
   2. Alternativamente, coloque 2,5 mL de sacarosa al 10% en un tubo de ultracentrífuga (consulte la Tabla de materiales). Incline el tubo y añada lentamente los 9 ml de muestra que contiene VLP (del paso 3.4.3) con una pipeta de baja velocidad. Durante esta operación, eleve progresivamente el tubo hasta una posición vertical.
3. Centrifugar las muestras a 209.490 × g en una ultracentrífuga durante 90 min a 4 °C.
   nota: Esta técnica se puede adaptar para la centrifugación a baja velocidad (4.300 × g) durante la noche.
4. Después de la centrifugación, retire el sobrenadante con cuidado y coloque el tubo boca abajo sobre papel de seda para eliminar cualquier líquido restante. Después de 1 minuto, agregue 100 μL de 1x PBS y coloque el tubo a 4 °C con una cubierta de parafilm en un soporte de tubo sobre una mesa de agitación durante 1 h (consulte la Tabla de materiales) antes de volver a suspender el pellet pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
   NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.

5. Monitoreo de la carga de Cas9 dentro de Nanoblades por dot-blot

1. Prepare el tampón de dilución añadiendo 1 volumen de tampón de lisis que contenga un tensioactivo no iónico (consulte la Tabla de materiales) en 4 volúmenes de 1x PBS. Diluya 2 μL de Nanoblades concentrados en 50 μL de tampón de dilución, vórtice brevemente, y transfiera 25 μL de esta mezcla a un nuevo tubo que contenga 25 μL de tampón de dilución. Repita esta operación para obtener 4 tubos de diluciones de Nanoblade (pasos de dilución de 2 veces).
2. Para los controles estándar, diluya 2 μL de nucleasa Cas9 recombinante (consulte la Tabla de Materiales) en 50 μL de tampón de dilución, vórtice brevemente, y proceda a realizar ocho diluciones en serie (dilución 2 veces para cada paso).
3. Localice cuidadosamente 2,5 μL de cada dilución de VLP y 2,5 μL de cada patrón en una membrana de nitrocelulosa con una pipeta multicanal (un volumen mayor puede dar lugar a puntos superpuestos).
   nota: También se puede utilizar una membrana de polivinildifluoruro tratada con metanol.
4. Una vez que las partículas se absorben en la membrana, bloquee la membrana con 1x solución salina tamponada con Tris que contenga un surfactante no iónico (TBS-T) suplementado con leche en polvo descremada (5% p/v) durante 45 minutos a temperatura ambiente><. nota: El protocolo se puede pausar aquí y la membrana se puede almacenar a 4 °C en 1x TBS-T.
5. Deseche el 1x TBST suplementado con leche en polvo descremada e incube la membrana durante la noche a 4 °C con el anticuerpo Cas9-rábano picante peroxidasa (dilución 1/1000 en 1x TBST, leche al 5%). Lave la membrana 3 veces con TBS-T y visualice la señal utilizando un kit de sustrato quimioluminiscente mejorado.
6. Cuantifique la intensidad del punto para las diluciones estándar de Nanoblades y Cas9 recombinante utilizando el software patentado proporcionado con la estación de imágenes en gel o imageJ. Defina una curva lineal que vincule la intensidad del punto con la concentración de Cas9. Utilizando la función de la curva obtenida, extrapolar el contenido de Cas9 en cada preparación.
   nota: La cantidad de proteína Cas9 recombinante de control puede saturar la lectura de las muestras más concentradas del conjunto de dilución estándar (Figura 2). Por lo tanto, se aconseja, al definir la curva lineal, eliminar la lectura de las muestras sin diluir (y a veces la de los primeros pasos de dilución) si no están en el rango lineal con respecto a la concentración conocida de Cas9 que se detectó. Del mismo modo, al extrapolar la cantidad de Cas9 dentro de las muestras de Nanoblade, utilice únicamente las lecturas que estén dentro del rango lineal de la curva estándar.

>6. Transducción de células diana con Nanoblades (procedimiento para la transducción en una placa de 12 pocillos)

1. En una placa de 12 pocillos, siembre de 100.000 a 200.000 células (ya sean primarias o células adherentes inmortalizadas) por pocillo en 1 mL del medio de cultivo celular apropiado. Permita que las células se adhieran a la superficie de la placa antes de la transducción.
2. En un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, agregue 5-20 μL de Nanoblades concentrados (del paso 3.5.1 o 4.4) a 500 μL de medio de cultivo celular, y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una pipeta P1000. Retire el medio de las células y reemplácelo con los 500 μL de esta mezcla de Nanoblade.
   nota: La transducción debe optimizarse para cada tipo de célula. Es importante utilizar el menor volumen posible de medio (evitando el secado de las células objetivo) para que las Nanoblades permanezcan altamente concentradas. Las células adherentes deben transducirse directamente mientras están unidas a la placa (no transducir en suspensión, ya que esto disminuirá significativamente la eficiencia de la transducción). Algunas células toleran la exposición prolongada a las Nanoblades (24-48 h), mientras que otras son muy sensibles y pueden formar pequeños sincitios. En este caso, las Nanoblades deben incubarse con células solo durante 4-6 h antes de reemplazar el medio. La espinoculación también puede mejorar la transducción de las células cultivadas en suspensión. Los adyuvantes, como los polímeros catiónicos (consulte la Tabla de materiales), también pueden mejorar la eficiencia de la transducción en algunos tipos de células.
3. Después de 4-6 h de incubación celular en un volumen bajo de medio que contenga Nanoblades, aumente el volumen de medio a la cantidad normal (1 mL si trabaja con una placa de 12 pocillos), o reemplácelo con medio fresco si las células son sensibles a VLPs.
   nota: El medio celular que contiene Nanoblades debe inactivarse con hipoclorito de sodio al 0,5% durante 10 minutos antes de desecharlo. Use guantes y gafas protectoras cuando manipule hipoclorito de sodio. Si las Nanoblades inducen la muerte celular, adapte la cantidad y el tiempo total de exposición para reducir la mortalidad celular.

Resultados

Figura 1: Morfología de las células productoras durante la producción de Nanoblade.(A) HEK293T las células al 70-80% de confluencia 24 h después de la siembra. (B y C) HEK293T morfología celular 24 h después de la transfección. (D) HEK293T morfología celular 40 h después de la transfección. Barras de escala = 400 μm.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
13.2 mL, Tubos de Polipropileno de Pared Delgada, 14 x 89 mm - 50Pk	Beckman Coulter Ciencias de la Vida	331372	Tubos de ultracentrifugación para la purificación de Nanoblades
Amersham Protran Premium Western membranas secantes, nitrocelulosa	Merck	GE10600004	Membrana de nitrocelulosa para cuantificar los niveles de Cas9 dentro de Nanoblades purificados
BIC-Gag-CAS9	Addgene	119942	Codifica una fusión GAG (F-MLV)-CAS9(sp). Permite la producción de partículas similares al virus GAG-CAS9 a partir de células productoras en asociación con ARNg sobreexpresados y envolturas apropiadas
BICstim-Gag-dCAS9-VPR	Addgene	120922	Codifica una fusión GAG-dCAS9-VPR para la activación transcripcional dirigida
hoja	Addgene	134912	Red troncal vacía para clonar la secuencia de sgRNA que se utilizará en el sistema Nanoblades
BsmBI-v2	Biolaboratorios de Nueva Inglaterra	R0739S	Enzima de restricción para digerir los vectores BLADE y SUPERBLADES para la clonación de sgRNA
Cas9 (7A9-3A3) mAb de ratón (conjugado HRP) #97982	Tecnología de señalización celular	97982S	Anticuerpo anti-Cas9 para la cuantificación de Cas9 por dot-blot
Cas9 Nucleasa, S. pyogenes	Biolaboratorios de Nueva Inglaterra	M0386T	Proteína Cas9 recombinante que se utilizará como referencia para la cuantificación absoluta de la cantidad de Cas9 cargada dentro de Nanoblades
Solución de bromuro de etidio (10 mg/mL en H2O)	Sigma-Aldrich	E1510-10ML	Para teñir geles de agarosa y visualizar el ADN
Agitadores de movimiento de olas de Fisherbrand	Fisher Científico	88-861-028	Mesa de agitación para resuspender las Nanoblades tras la centrifugación
gelAnalyzer			http://www.gelanalyzer.com; cuantificación de la intensidad de la banda después de la digestión
Gesicle Producer 293T	Takara	632617	Línea celular productora de Nanoblades
Gibco DMEM, alto contenido de glucosa, piruvato	ThermoFisher Scientific	41966052	Medio de cultivo celular para células Gesicle Producer 293T
Kit de reactivos de transfección jetPRIME para ADN y ADN/siRNA	Polyplus	POL114-15	Reactivo de transfección para la producción de Nanoblade en células Gesicle Producer 293T
Millex-AA, 0,80 μm, filtro de jeringa	Millipore	SLAA033SS	Filtro de jeringa para eliminar los residuos celulares antes de la concentración de Nanoblades
Millex-GS, 0,22 μm, filtro de jeringa	Millipore	SLGS033SS	Filtro de jeringa para esterilizar la solución de almohadilla de sacarosa
Millex-HP, 0,45 μm, polietersulfona, filtro de jeringa	Millipore	SLHP033RS	Filtro de jeringa para eliminar los residuos celulares antes de la concentración de Nanoblades
Kit de extracción de gel de ADN monarca	Biolaboratorios de Nueva Inglaterra	T1020L	Kit de extracción de gel de ADN para la purificación del fragmento de plásmido pBLADES o pSUPERBLADES en la digestión con BsmBI
NEB E. coli estable y competente (alta eficiencia)	Biolaboratorios de Nueva Inglaterra	C3040I	Bacterias competentes para la transformación y amplificación de plásmidos
Kit NucleoBond Xtra Midi para ADN plasmídico de grado de transfección	Macherey-Nagel	740410.5	Kit de maxipreparación para la purificación de ADN plasmídico a partir de bacterias cultivadas
Kit de extracción de ADNg de nucleospina	Macherey-Nagel	740952.5	Extracción de ADN genómico de células transducidas
NucleoSpin Plasmidio, Mini kit para ADN plasmídico	Macherey-Nagel	740588.5	Kit de minipreparación para la purificación de ADN plasmídico a partir de bacterias cultivadas
NucleoSpin Tissue, Mini kit para ADN de células y tejidos	Macherey-Nagel	740952.5	Kit de extracción de ADN genómico
Optima XE-90	Beckman Coulter Ciencias de la Vida	A94471	Ultracentrífuga
pBaEVRless	Els Verhoeyen (Inserm U1111)	Las solicitudes personales deben enviarse a: els.verhoyen@ens-lyon.fr	Babuino Retrovirus endógeno Glicoproteína Rless descrita en Girard-Gagnepain, A. et al. Los LV pseudotipados con envoltura de babuino superan a los VSV-G-LV para la transferencia de genes a HSC estimuladas por citocinas tempranas y en reposo. Blood 124, 1221–1231 (2014)
pBS-CMV-gagpol	Addgene	35614	Enocdes el virus de la leucemia murina gag y los genes pol
pCMV-VSV-G	Addgene	8454	Proteína de envoltura para la producción de partículas lentivirales y retrovirales MuLV
solución salina tamponada con fosfato (PBS)	ThermoFisher Scientific	14200091	10X PBS para diluir en agua en miliporos
Reactivo de transfección de polibreno	Millipore Sigma	TR-1003-G	Polímero catiónico que mejora la eficiencia de la transducción retroviral en células específicas de mamíferos. También puede permitir la entrada dependiente de virus de un oligodesoxinucleótido (ODN) para la reparación dirigida por homología
Sacarosa, para biología molecular, ≥99,5% (GC)	Sigma-Aldrich	S0389-5KG	Sacarosa para preparar un cojín para la purificación de Nanoblade mediante ultracentrifugación
SUPERBLADE5	Addgene	134913	Red troncal vacía para clonar la secuencia de sgRNA que se utilizará en el sistema de nanoblades (Optimizado para aumentar la eficiencia de la edición del genoma a través de Chen B et al., 2013)
Sustrato de larga duración SuperSignal West Dura	ThermoFisher Scientific	34076	Sustrato HRP de quimioluminiscencia mejorada (ECL) para blots de puntos Cas9
SW 41 Ti Rotor de cuchara oscilante	Beckman Coulter Ciencias de la Vida	331362	Rotor para ultracentrifugación
SYBR Tinción de gel de ADN seguro	ThermoFisher Scientific	S33102	Alternativa al bromuro de etidio para teñir geles de agarosa y visualizar el ADN
ADN ligasa T4	Biolaboratorios de Nueva Inglaterra	M0202S	ADN ligasa para ligar los vectores BLADE o SUPERBLADES con los oligonucleótidos de ADN dúplex correspondientes a la región variable del sgRNA
Tampón de lisis que contiene Triton	Promega	E291A	Tampón de lisis para interrumpir los Nanoblades y permitir la cuantificación de Cas9
PREADOLESCENTE 20	Sigma-Aldrich	P9416	Para la preparación de TBST