Microinyección de embriones de mosquitos: una técnica para introducir ADN exógeno en la yema del embrión de Anopheles gambiae para generar mutaciones de la línea germinal

Resumen

Fuente: Carballar-Lejarazú, R. et al, Método de microinyección para embriones de Anopheles gambiae. J. Vis. Exp. (2021).

En este video, demostramos la entrega de una construcción de impulsor genético en el embrión del mosquito Anopheles gambiae a través de la técnica de microinyección de embriones. Este procedimiento permite la integración de la construcción de ADN entregada, a través de la recombinación homóloga, en las células de la línea germinal para generar una población de mosquitos transformada.

Protocolo

1. Microinyección de embriones

1. Utilice una punta de microcargador para llenar las agujas con 2 μL de mezcla de ADN (ADN plasmídico a una concentración de 300-400 ng/μL. Inserte la aguja en el soporte de la aguja y conecte el tubo de la bomba de presión automatizada (Figura 1).
2. Importante: Alinee la aguja de modo que forme un ángulo de 15° con el plano de la corredera (Figura 1).
3. Abra la punta de la aguja tocando con cuidado el primer huevo del mosquito Anopheles gambiae e inyecte insertando la punta de la aguja ≤ 10 μm en el polo posterior. Una inyección exitosa conducirá a un pequeño movimiento del citoplasma dentro del óvulo.
4. Utilice los controles de la etapa coaxial del microscopio para pasar al siguiente huevo y continuar con la inyección.
   1. Para asegurarse de que la punta de la aguja permanezca abierta y no se haya obstruido, presione el botón Inyectar antes de ingresar a otro embrión y visualice la pequeña gota en la apertura de la aguja.
   2. Si la aguja se obstruye, presione el botón Borrar para limpiar la aguja y repita la prueba de visualización de gotas. Ajuste la presión según sea necesario si la abertura de la punta de la aguja se hace ligeramente más grande para asegurarse de que el tamaño de la gota permanezca pequeño.
   3. Inyecte ~ 40-50 huevos con una aguja.
      nota: Asegúrate de que el papel de filtro permanezca húmedo en todo momento. Mantenga suficiente contrapresión sobre la aguja para mantenerla despejada. Una aguja que no se puede desatascar debe ser reemplazada por una aguja nueva. La colocación del embrión, la inserción de la aguja y la inyección se facilitan con microscopios que tienen controles coaxiales para el movimiento horizontal de la platina (Figura 2).
5. Una vez completadas las inyecciones, enjuague los huevos en un recipiente de vidrio forrado con papel de filtro y lleno con 50 mL de H2O desionizado (Figura 3).
   nota: Los embriones comenzarán a eclosionar 2 días después de la inyección y pueden tardar entre 3 y 5 días. Las larvas del primer estadio eclosionadas deben transferirse inmediatamente (revisar 2 veces al día) a un recipiente limpio con agua y comida.

Resultados

Figura 1: Posición de la aguja durante las microinyecciones. A) Vista gran angular de la etapa de inyección. B,C) Coloque la aguja de modo que los embriones alineados formen un ángulo de 15° con la aguja de inyección. No eleve el brazo del instrumento de microinyección que sostiene la aguja significativamente más alto que la etapa del microscopio para asegurar un ángulo adecuado entr...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
10x Tampón de microinyección	-	-	1 mM tampón NaHPO4, pH 6,8, 50 mM KCl
Membrana de transferencia (membrana de transferencia Zeta-Probe GT Genomic Tested)	Bio-Rad		Cortado de forma ordenada y recta en una pieza de 2x1 cm
Agua desionizada o bidestilada (ddH20)	Mili-Q		En una botella de lavado
Microscopio de disección	Leica	Leica MZ12	Para la alineación de embriones
Envase de vidrio	pyrex	No. 3140	125 x 65
Corredera de vidrio	Marca Fisher	No. 12-549-3	75x26 milímetros
Microinyector	Instrumento Sutter		Microinyector digital XenoWorks
Microcargador Puntas de pipeta	Eppendorf		Microcargador de 20 μL epT.I.P.S.
Micromanipulador	Instrumento Sutter		Micromanipulador XenoWorks
micropipeta	Lluvia		20 μL
microscopio	Leica	DM 1000 LED o M165 FC	para microinyección
Malla de nailon
Pincel	Blick	N° 05831-7040	Fino, talla 4/0
placa de Petri			Plástico, (60x15 mm, 90x15 mm)