Entrega hidrodinámica de genes: una técnica para la transfección in vivo de ADN exógeno en hepatocitos murinos mediante inyección en la vena de la cola

Resumen

Fuente: Hübner, E. K. et al., Sistemas constitutivos e inducibles para la modificación genética in vivo de hepatocitos de ratón mediante inyección hidrodinámica de venas de cola. J. Vis. Exp. (2018).

Este video describe la técnica de transfección genética in vivo de hepatocitos murinos mediante inyección hidrodinámica de venas de cola. Este sistema de transfección genera una expresión a largo plazo del transgén en los hepatocitos.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado animal y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Preparación de la solución para la inyección hidrodinámica de venas de cola

NOTA: Prepare las construcciones de plásmidos para la expresión génica constitutiva e inducible mediante la técnica de clonación utilizando bacterias competentes.

1. Prepare solución salina estéril al 0,9% para inyección (no use PBS). Utilice el volumen correspondiente a aproximadamente el 10% del peso corporal del ratón. Ejemplo: para un ratón que pesa 20 g, prepare 2 mL de solución.
2. Preparar vectores de inyección que se purificaron utilizando un kit de purificación de plásmidos libre de endotoxinas.
3. Agregue 10 μg o 15 μg de construcción vectorial de la bella durmiente libre de endotoxinas (use 10 μg, a partir del paso 4 use 15 μg, respectivamente) y 1 μg de pc-HSB5 libre de endotoxinas por mL de solución salina estéril.
4. Almacene la solución hasta 4 h a 4 °C. No congelar.

>2. Realización de la inyección hidrodinámica de la vena de cola

1. Use un retenedor para la inyección de la vena de la cola (comercial o preparado a partir de un tubo cónico de 50 mL con orificios para la respiración y para la cola). Llena el fondo del tubo con papel de seda.
2. Para la inyección, utilice ratones de aproximadamente 8 a 10 semanas de edad con pesos de 20 a 25 g.
3. Pesar los ratones antes de la inyección y preparar el volumen de inyección de acuerdo con el peso corporal (correspondiente al 10% del peso corporal). Prepare una jeringa estéril de 3 ml con una aguja de 27 G para inyección y llénela con el volumen requerido.
4. Coloque el ratón en el restricción. Ajuste la cantidad de papel de seda para dejar solo un espacio mínimo para el movimiento, pero suficiente espacio para respirar.
5. Asegúrese de que el ratón respire con regularidad.
6. Calienta la cola con una lámpara infrarroja durante 30-60 segundos. Esté atento a los signos de sobrecalentamiento.
7. Limpia la cola con un hisopo con alcohol.
8. Inserte la aguja casi horizontalmente en cualquiera de las dos venas laterales de la cola cerca de la base de la cola.
   nota: Si se coloca con éxito, una pequeña cantidad de sangre podría fluir de regreso al cono de la aguja. No se recomienda aspirar activamente, ya que cualquier movimiento adicional de la aguja puede provocar su desplazamiento y/o lesiones en la vena.
9. Inyecte el volumen total en la vena de la cola dentro de los 8-10 s.
10. Retire inmediatamente el ratón del restenedor. Comprima la herida inyectable durante al menos 30 segundos o hasta que el sangrado disminuya.
11. Coloca al ratón en una jaula separada. Una vez que el ratón se haya recuperado del procedimiento (alrededor de 30 a 60 minutos), transfiéralo de nuevo a su jaula original. Compruebe el ratón regularmente durante las próximas 24 h.
    nota: La sedación leve del ratón se observa de forma rutinaria hasta 2 horas después de la inyección.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
NaCl 0,9%	Braun	3200905	Portador para inyecciones intravenosas
Tubo Cónico Falcon 50ml	Ciencias de la vida de Corning	352095
Lámpara infrarroja	N/A	N/A	Para calentar la cola del ratón
Plásmidos para la clonación de vectores de transposones de la bella durmiente para HTVI.
pTC	N/A		Vector para la expresión génica constitutiva
pEN_TTmcs	Addgene	#25755	Vector de entrada para la expresión génica inducible
pEN_TTGmiRc2	Addgene	#25753	Vector de entrada para la expresión de miRshRNA inducible con coexpresión de GFP
pEN_TTmiRc2	Addgene	#25752	Vector de entrada para la expresión inducible de miRshRNA sin coexpresión de GFP
pTC ApoE-Tet	Addgene	#85578	Vector de expresión para la expresión de genes inducibles o miR-shRNA con el promotor ApoE.HCR.hAAT
pTC-CMV-Tet	Addgene	#85577	Vector de expresión para la expresión de genes inducibles o miR-shRNA con promotor de CMV