Transformación genética mediada por agrobacterias: un método para transformar genéticamente el genoma del arroz a través de Agrobacterium tumefaciens modificado genéticamente

Resumen

Fuente: Xu, D., et al. Transformación genética mediada por agrobacterias, producción transgénica y su aplicación para el estudio del desarrollo reproductivo masculino en arroz. J. Vis. Exp. (2020).

En este video, demostramos la transformación genética del genoma del arroz utilizando un vector binario de Agrobacterium tumefaciens. Esta bacteria facilita la transferencia de un plásmido de ADN extraño utilizando proteínas de virulencia de Agrobacterium.

Protocolo

1. Transformación genética del arroz y cultivo de tejidos vegetales

1. Inducción y regeneración de callos
   nota: Utilice inflorescencias frescas de arroz joven como material de partida para inducir el callo (Figura 1).
   1. Recoja las inflorescencias jóvenes del arrozal o invernadero en la etapa de meiosis, determinada por la longitud del florete de 1,6-4,8 mm (Figura 1A). Asegúrese de que las inflorescencias del arroz estén cubiertas con la vaina de las hojas. Limpie cada inflorescencia con un hisopo con alcohol al 70% y déjela secar antes de cortar.
   2. Lleve la inflorescencia a un banco limpio y estéril. Córtelo en trozos pequeños (cuanto más pequeños, mejor) con tijeras esterilizadas y luego transfiera los esquejes a una placa de Petri que contenga medio NBD2 (Figura 1B, Tabla 1).
   3. Incubar la placa en la oscuridad a 26 °C durante unos 10-14 días para inducir callo (Figura 2A).
      nota: Utilice el callo recién formado para la infiltración de Agrobacterium (paso 1.2.7) directamente o reacondicione una vez más en medio NBD2 fresco para obtener más callo. Transfiera el callo al nuevo medio NBD2 cada 8 a 10 días.
2. Transformación y cocultivo
   1. Utilice la bacteria A. tumefaciens que contiene el plásmido binario con la construcción sgRNA-CAS9 para la transformación. Almacene las cepas de A. tumefaciens en medio YEB (Tabla 1) con 50% de glicerol a -80 °C para su uso posterior.
   2. La raya A. tumefaciens pasa de un stock de glicerol de -80 °C a un medio de agar YEB que contiene antibióticos selectivos (Tabla 1) y crece a 25-28 °C durante 48-72 h, para permitir la aparición de colonias.
   3. Inocular una sola colonia de la placa YEB con antibióticos selectivos a 5 mL de medio líquido YEB que contenga los mismos antibióticos selectivos (Tabla 1), en un tubo de ensayo cónico estéril de 50 mL. Agitar en un agitador orbital a 250 x g, a 25–28 °C hasta que las bacterias crezcan hasta un diámetro exterior de₆₀₀ de 0,5.
   4. Añadir 1 mL de suspensión bacteriana a 100 mL de medio YEB (Tabla 1) con los mismos antibióticos selectivos en un matraz cónico de 250 mL y agitar en un agitador orbital a 250 x g, a 28 °C durante 4 h.
   5. Centrifugar a 4.000 x g durante 10 min a temperatura ambiente para recoger las bacterias. Deseche el sobrenadante.
   6. Vuelva a suspender el pellet bacteriano con medio AAM-AS (Tabla 1) y diluya la suspensión hasta un diámetro exterior de₆₀₀ = 0,4.
      nota: El diámetro exterior perfecto de la suspensión bacteriana es fundamental para una transformación eficiente. Ayuda a eliminar el exceso de crecimiento bacteriano en el callo.
   7. Recoja alrededor de 150 callos embriogénicos frágiles de color amarillo claro en crecimiento sanos del paso 1.1.3 en un matraz estéril de 150 ml. Añada 50-75 mL de suspensión de células bacterianas del paso 1.2.6 en el matraz estéril y, a continuación, añada unos 10-25 mL de medio AAM-AS fresco para sumergir los callos durante 10-20 min, agitando de vez en cuando.
   8. Vierta la suspensión bacteriana del matraz con cuidado y seque el exceso de suspensión bacteriana del callo con papel de filtro estéril #1 o papel de seda. Luego colóquelos en una placa de Petri con medio NBD-AS (Tabla 1) cubierta con un papel de filtro estéril # 1. Incubar a 25-28 °C en la oscuridad durante 3 días y comprobar si hay sobrecrecimiento bacteriano.
3. Selección para callo resistente
   1. Después de 3 días de cocultivo, transfiera los callos a una placa de Petri estéril con un papel de filtro estéril.
   2. Secar al aire el callo durante 2 h en un banco limpio. Asegúrese de que el callo no se adhiera al papel de filtro.
   3. Transfiera los callos uniformemente con pinzas estériles al medio de selección primario NBD2 (con 40 mg/L de higromicina y 250 mg/L de timentina) (Tabla 1). Cultivo de callos durante 2 semanas a 25-28 °C en la oscuridad.
   4. Después de 2 semanas, transfiera los callos uniformemente a una nueva placa que contenga medio de selección fresco NBD2 (con 40 mg/L de higromicina y 250 mg/L de timentina) (Tabla 1). Cultive los callos durante otras 2 semanas a 25-28 °C en la oscuridad.
4. Diferenciación de callos
   1. Transfiera el callo a un medio MS fresco (con 25 mg/L de higromicina y 150 mg/L de timentina) (Tabla 1). Cultivo bajo luz a 25-28 °C durante unas 2 semanas.
   2. Repita el paso 1.4.1 una vez más.
   3. Transfiera las yemas de los brotes al nuevo medio MS (con 10 mg/L de higromicina) para que proliferen más brotes.

Tabla 1: Composiciones de medios para la transformación del arroz. Por favor, haga clic aquí para descargar esta tabla.

Resultados

Figura 1: Materiales de partida para inducir callos. (A) Inflorescencias de arroz joven en etapa de meiosis. (B) Inflorescencias jóvenes disecadas que crecen en el medio NBD2. Barra = 2 cm en (A).

Figura 2: Procedimiento para la producción de líneas tr...