Entrega de genes in vitro mediada por electroporación: una técnica de pulso eléctrico para introducir plásmidos fluorescentes que codifican proteínas reporteras en células cultivadas

Resumen

Fuente: Lo, J. C. W. et al., Método de electroporación eficiente y rentable para estudiar las vías de señalización primarias dependientes del cilio en el precursor de células granulosas.J. Vis. Exp.(2021)

Este video demuestra la técnica de electroporación que introduce ADN plásmido codificante de proteínas fluorescentes en precursores de células granulosas cerebelosas primarias de ratón.

Protocolo

1. Electroporación para la sobreexpresión de transgenes del receptor Hh: pEGFP-Smo

1. Para la electroporación con una cubeta de 2 mm de espacio, prepare la siguiente mezcla de electroporación de plásmidos y celdas para cada reacción de electroporación: 1,2 × 10⁶ células precursoras de células granulosas cerebelosas primarias de ratón y 10 μg de pEGFP-mSmo (ajuste la concentración de stock de ADN a ~2-5 μg/μL en tampón Tris-EDTA o dH₂O estéril) en 100 μL de Opti-MEM.
   nota: Reduzca el número total de celdas si las celdas son insuficientes (aunque esto puede reducir la eficiencia de la electroporación). Sin embargo, no ajuste la cantidad de plásmido ni el volumen total de Opti-MEM utilizado por cubeta. Si el número total de células necesarias para el experimento supera 1,5 × 10⁶ células, aumente la escala de la mezcla de electroporación en consecuencia y realice múltiples reacciones de electroporación por separado. La cubeta se puede reutilizar hasta 5 veces.
2. Prepare la placa de siembra de la célula posterior a la electroporación añadiendo 0,5 mL de medio de cultivo en cada pocillo de la placa de cultivo de 24 pocillos que contiene cubreobjetos recubiertos y manténgala caliente a 37 °C en una incubadora de CO₂. Para preparar los cubreobjetos para la fijación de células, incube cubreobjetos de vidrio de 12 mm esterilizados en autoclave con 100 μg/mL de poli-D-lisina (PDL, 1 mg/mL en dH₂O) estériles durante al menos 1 h a 37 °C. Mantenga los cubreobjetos en la misma solución de PDL a 4 °C hasta su uso.
3. Pipetear el número requerido de células en un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mL y centrifugar a 200 × g durante 5 min en RT. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de células en 200 μL de Opti-MEM. Repita este paso dos veces con Opti-MEM para asegurarse de que no haya ningún medio de cultivo residual en el tubo.
   nota: Por cada pocillo/cubreobjetos de una placa de 24 pocillos, electroporar y sembrar 1,2-1,3 × 10⁶ células/pocillo para obtener ~70-75% de confluencia celular al siguiente día de cultivo.
4. Establezca los parámetros de electroporación como se muestra en la Tabla 1.
5. Pipetear suavemente la reacción de electroporación para mezclar bien y utilizar una punta larga P200 para transferir un volumen exacto de 100 μL de la mezcla a la cubeta de 2 mm de espacio. Evite formar burbujas.
6. Coloque la cubeta en la cámara de la cubeta.
7. Presione el botón Ω del electroporador (consulte la Tabla de materiales) y tome nota del valor de impedancia, que debe ser ~30-35. Para garantizar que el valor de impedancia eléctrica Ω se encuentre dentro del rango de 30-35, adhiérase a un volumen preciso de 100 μL.
8. Presione el botón de inicio para iniciar el pulso.
9. Registre los valores de la corriente medida y los julios que se muestran en el marco de lectura.
10. Retire la cubeta de la cámara de la cubeta.
11. Añada inmediatamente 100 μL de medio de cultivo precalentado en la cubeta y vuelva a suspenderla pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo 2-3 veces. Transfiera inmediatamente la suspensión de la celda a la placa de 24 pocillos que contiene cubreobjetos recubiertos preparada en el paso 1.2.
    nota: Para minimizar la muerte celular, siembre las células inmediatamente después de la electroporación.
12. Incubar las células a 37 °C en una incubadora de CO₂. Deje las células intactas durante 3 h para evitar el desprendimiento de las células.
13. A las 3 h después de la siembra, aspire suavemente y deseche la mitad del medio sobrenadante para eliminar las células muertas flotantes y los desechos y reemplácelos con la misma cantidad de medio de cultivo precalentado.
14. Incubar las células a 37 °C en la incubadora de CO₂.

	Ajuste de pulso de poro		Ajuste de pulso de transferencia
	GCP principales del ratón	Neuronas primarias	GCP principales del ratón	Neuronas primarias
voltaje	275 V	275 V	20 V	20 V
largura	1 ms	0,5 ms	50 ms	50 ms
intervalo	50 ms	50 ms	50 ms	50 ms
No.	número arábigo	número arábigo	5	5
Tasa D	10%	10%	40%	40%
polaridad	+	+	±	±

Tabla 1: Los parámetros de electroporación de los GCP primarios de ratón y las neuronas primarias utilizando el tipo NEPA21 DEL Super Electroporador

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Suplemento de B27	Tecnologías de la Vida LTD	17504044
GlutamMAXTM-I ,100x	Gibco, Tecnologías para la Vida	35050061	Sustituto de la L-glutamina
Matrigel	BD Biociencias	354277	Matriz de membrana basal
Neurobasal	Gibco, Tecnologías para la Vida	21103049
Hidrobromuro de poli-D-lisina	Sigma Aldrich	P6407
Cámara de cubetas CU 500	Nepagene	CU500
Cubeta de electroporación EPA (espacio de 2 mm)	Nepagene	CE - Prueba documental 002
Opti-MEM	Tecnologías de la Vida LTD	31985070	Medio de suero reducido para la transfección
pEGFP-mSmo	Addgene	25395
Súper Electroporador NEPA21 TIPO II Electroporación In Vitro e In Vivo	Nepagene	NEPA21	Electroporador