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1. Nucleofección de merozoítos o esporozoítos
- Preparación antes de la nucleofección de parásitos
- Prepare alrededor de 107 merozoítos o esporozoítos en un tubo. Si transfecta merozoítos, prepare 3-4 tubos.
- Prepare una cantidad de ADN plasmídico o fragmento de PCR purificado que sea mayor o igual a 10 μg.
nota: El plásmido utilizado en este estudio contiene 2 genes: proteína fluorescente amarilla mejorada (EYFP) y dihidrofolato reductasa timidilato sintasa derivada de Toxoplasma gondii (TgDHFR-TS).
- Prepare 25 U de enzima de restricción. Si los plásmidos están linealizados, la enzima de restricción puede mejorar la eficiencia de la transfección. Si los plásmidos son circulares, omita la enzima de restricción.
- Preparar 85 μL de tampón de nucleofección (Tabla 1): mezclar 20 μL de tampón de nucleofección I y 1 mL de tampón de nucleofección II y utilizar una parte de la solución. El volumen del tampón total es de 100 μL.
- Nucleofección
- Centrifugar la suspensión de esporozoíto o merozoíto a 600 x g durante 10 min. A continuación, deseche el sobrenadante.
- En el siguiente orden, agregue 85 μL de tampón de transfección nuclear, 10 μg de plásmido (fragmento de PCR) y 25 U de enzima de restricción (generalmente 5 μL) en el tubo de 1,5 mL que contiene esporozoítos o merozoítos.
- Transfiera la suspensión a una taza de transfección nuclear. Coloque la copa en una ranura de transferencia nuclear.
- Encienda el dispositivo de nucleofección usando el botón de encendido y seleccione el procedimiento de transfección U-033. Si el dispositivo de nucleofección se inicia en el modo de elección de programa libre, salga de este modo presionando el botón X.
- Cuando finalice el programa, presione el botón X del dispositivo de nucleofección y la pantalla debería mostrar OK, lo que indica que la nucleofección se ha realizado correctamente.
- Agregue 0,5-1 mL de Dulbecco's Modified Eagle ́s Medium (DMEM) a la taza de nucleofección para detener la reacción y transfiera la suspensión a un tubo de 1,5 mL después de mezclar suavemente.
| búfer
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composición
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| Tampón de nucleofección I | ATP-disódico 2 g, MgCl2-6H 2O 1,2 g, 10 ml de agua |
| Tampón de nucleofección II | KH2PO4 6 g, NaHCO3 0,6 g, glucosa 0,2 g, 500 ml de agua |
| *Agua: agua destilada | |
Tabla 1: Composición de los tampones.