$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
>1. Eliminar las células del cúmulo de los óvulos fertilizados.
- Bajo un microscopio estereoscópico, use 2 jeringas de insulina: la primera para sujetar el oviducto y la segunda para romper la ampolla y dispersar los óvulos fertilizados en la solución de trabajo de hialuronidasa.
- Tome la pipeta de vidrio preparada para recoger los huevos y conéctela al tubo y a un filtro de 0,22 μm montado en la boquilla para aspirar todos los huevos. Recoja todos los huevos y lávelos por paso sucesivo en 6 gotas diferentes de 100 μL de medio M2.
- Coloque los huevos fertilizados lavados en una incubadora humidificada a 37 °C con una atmósfera de 5% de CO2 en medio M16.
>2. Fabricación de pipetas de inyección
- Utilice un tubo capilar de vidrio de pared delgada (10-15 cm de largo) con un diámetro exterior de 1 mm y sujete este capilar en un extractor de micropipetas horizontal.
nota: En la mayoría de los extractores de pipetas horizontales, se pueden ajustar 3 parámetros: potencia calorífica, fuerza de tracción y retardo de tiempo entre el calentamiento y la extracción. Ajuste estos parámetros para obtener pipetas inyectables que se asemejen a la que se presenta en la Figura 1A. Para los usuarios que realizan microinyección de ADN de forma rutinaria, utilice la configuración estándar y ajuste el retraso entre el calentamiento y la extracción para cambiar la forma global de la punta de la pipeta.
>3. Fabricación de pipetas de retención
- Utilice una pipeta de inyección para preparar la pipeta de sujeción.
- Conecte una pipeta de inyección a una microfragua. Corte la pipeta con la microforja para obtener una punta afilada y simétrica de 80 a 100 μm de diámetro. A continuación, pulir la punta con calor en la microforja para obtener una forma redonda simétrica sin setos afilados.
>4. Preparación de la pipeta inyectable que contiene el vector lentiviral
- Centrifugar la suspensión del vector lentiviral a 160 x g durante 2 min en los restos de pellets que suelen estar presentes en las existencias lentivirales congeladas.
- Recupere el sobrenadante y transfiéralo a un nuevo tubo de 0,5 mL en una cabina de seguridad de clase II.
- Transfiera 1 μL de sobrenadante a una pipeta de inyección preparada como se describe en el paso 5 utilizando un microcargador.
- Coloque la pipeta de inyección en el soporte del instrumento del micromanipulador derecho. Conecte la pipeta de retención al micromanipulador izquierdo.
nota: El título de transducción del vector lentiviral se correlacionará directamente con la eficacia de la producción fundadora. Para una alta eficacia (>70%), utilice vectores virales con un título en el rango de 100 ng de proteína de cápside p24/μL. Cuando el título se expresa como unidades de transducción (UT), el título debe ser superior a 109 TU/mL. Las existencias de vectores lentivirales deben producirse por transfección transitoria de células 293T con el plásmido de encapsidación p8.91, pHCMV-G, que codifica la glicoproteína-G del virus de la estomatitis vesicular (VSV) como se describe en los métodos complementarios.
5. Micro-inyección
- Dispensar 8 μL de medio M2 en el centro de un portaobjetos de depresión y cubrir con aceite de parafina ligero (probado con embriones) para evitar la evaporación.
- Coloque 20 huevos en la gota lo menos dispersos posible.
cautela: No hacer burbujas al depositar los embriones.
- Asegúrese de que la punta de la pipeta de inyección esté abierta. De lo contrario, golpee la pipeta de inyección con la pipeta de retención.
- Ajuste el microinyector para un tiempo de inyección de 20 s.
nota: La viscosidad de la suspensión viral permite una visualización clara de la dispersión del vector viral en el espacio perivitelino. La presión de inyección debe ajustarse para llenar todo el espacio dentro de los 20 segundos posteriores a la inyección, lo que representa un volumen de 10 a 100 pL. La presión de inyección no debe exceder los 600 hPa.
- Aspire un óvulo fertilizado que contenga 2 pronúcleos y 2 cuerpos polares con la pipeta de retención bajo el microscopio estereoscópico.
- Inyecte el óvulo con el microinyector en el espacio perivitelino.
cautela: No toque la membrana plasmática con la pipeta de inyección.
- Inyecte todos los óvulos fertilizados disponibles en lotes de 20 huevos y coloque los óvulos inyectados inmediatamente en un medio M16 precalentado en la incubadora humidificada a 37 °C con una atmósfera de 5% de CO2.
nota: Incubar los óvulos inyectados durante un mínimo de 30 minutos después de la inyección antes de las transferencias de embriones.
