Administración de genes lentivirales asistida por láser: una técnica para permeabilizar óvulos fertilizados de ratón para facilitar la entrega de genes lentivirales

Resumen

Fuente: Martin, N. P., et al. Entrega de genes lentivirales asistida por láser a óvulos fertilizados de ratón. J. Vis. Exp. (2018).

En este video, demostramos la permeación asistida por láser de la capa protectora de la zona pelúcida en óvulos fertilizados de ratón para facilitar la entrega de genes lentivirales. El lentivirus permite la generación de animales transgénicos con un gen de interés integrado de forma estable en su genoma.

Protocolo

1. Perforación de óvulos fertilizados de ratón con láser XYClone

1. Configure y calibre el láser XYClone de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Otros láseres, normalmente utilizados para la fertilización in vitro, pueden sustituirse por el láser XYClone para perforar los óvulos fertilizados.
   1. Conecte el cable de la caja del controlador láser al aparato láser del microscopio.
   2. Conecte la caja del controlador láser a la computadora que ejecuta el software láser a través de un puerto USB. 3.1.3. Conecte el controlador láser y enciéndalo.
   3. Mirando a través del ocular, perfore una muestra de prueba (por ejemplo, marcas de borrado en seco en un portaobjetos de vidrio).
   4. Utilice un destornillador pequeño (incluido en el kit láser) para ajustar las posiciones X e Y del láser para que coincida con la luz LED visible a través del ocular del microscopio y calibre el láser.
2. Coloque una placa KSOM que contenga óvulos fertilizados de ratón en la platina del microscopio. No mantenga la placa fuera de la incubadora durante más de 15 minutos.
3. Mire a través del ocular del microscopio y asegúrese de que la zona pelúcida del embrión esté enfocada y que la luz LED del láser sea visible.
4. Mueva la platina del microscopio para apuntar a la zona con la luz LED/láser.
5. Usando el software de la computadora, configure el láser XYClone a 250 μs.
6. Ajuste el tamaño de la luz LED a las dimensiones deseadas (configuración 5 en este experimento).
7. Perfore la zona de cada óvulo fertilizado tres veces con el láser. La zona puede ser perforada o adelgazada. Con los ajustes anteriores, el láser producirá un orificio con un diámetro de 10 μm (Figura 1).
   nota: Apuntar cerca del cuerpo polar mantiene el láser alejado de la célula embrionaria.
8. Deje que los óvulos fertilizados se recuperen durante 2 h en la incubadora de cultivo de tejidos antes de pasar al siguiente paso.

2. Transducción de óvulos fertilizados de ratón después de la perforación con láser XYClone

1. Pipetear 2 μL de lentivirus concentrado (título superior a 1e8 TU/mL) en la gota de KSOM de 50 μL. No pipetee hacia arriba y hacia abajo. Los óvulos fertilizados se adhieren fácilmente a la punta de la pipeta. Según nuestra experiencia, las unidades transductoras de lentivirus 1e5-5e5 en un volumen inferior a 3 μL son óptimas para la administración de genes.
2. Permita que los óvulos fertilizados se conviertan en blastocisto durante 4 días en la incubadora. No es necesario cambiar los medios.

3. Transferencia no quirúrgica de embriones de ratón transducidos a ratones pseudo-preñados

1. Utilice ratones pseudopreñados, 3,5 días después del apareamiento.
2. Utilice el dispositivo de transferencia de embriones no quirúrgico (NSET) para implantar embriones de ratón en ratones pseudoembarazadas.
   1. Con un microscopio quirúrgico o de disección, inserta un espéculo vaginal para visualizar el cuello uterino.
   2. Inserte el dispositivo de transferencia de embriones no quirúrgico (NSET) aproximadamente 5 mm en el cuello uterino y deposite los embriones en un volumen de aproximadamente 2 μL.
      nota: Se utiliza un dispositivo NSET estéril para cada transferencia y se desecha después del procedimiento. Todos los reactivos utilizados en la manipulación de los embriones deben ser estériles.
3. Transfiera de 10 a 15 blastocistos sanos en un volumen de 2 μL de KSOM a cada ratón pseudopreñado.
4. Continúe monitoreando y midiendo el aumento de peso en ratones pseudopreñados en los días siguientes para determinar si el NSET fue exitoso.
5. Recupere a las crías permitiendo que las ratas preñadas den a luz de forma natural o realizando una cesárea 17 días después de la transferencia embrionaria. A menudo es necesaria una cesárea si hay muy pocos embriones y crecen demasiado para el parto natural.
6. Recoja tejido de las crías para el genotipado a fin de determinar la tasa de transgénesis.

Resultados

Figura 1: Tratamiento con láser de óvulos fecundados de ratón. Ejemplos de perforación de la zona para producir un agujero vs adelgazamiento de la zona.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Plásmido CD510B-1	Biociencias de Sistemas	CD510B-1	utilizado para empaquetar el lentivirus que expresa EF1a-copGFP
Dimetilpolisiloxano	sigma	DMPS5X	Cultivo de embriones
Láser XYClone	Hamilton Thorne Biociencias		Perforación de huevos fertilizados de ratón
Dispositivo de transferencia de embriones no quirúrgico (NSET)	ParaTechs	60010	NSET de embriones
KSOM medio	Millipore	MR-020P-5F	Cultivo de embriones
Composición de KSOM:			mg/100mL
NaCl			555
Kcl			18.5
KH2PO4			4.75
MgSO4 7H2O			4.95
CaCl2 2H2O			25
NaHCO3			Artículo 210
glucosa			3.6
Na-piruvato			2.2
DL-Ácido láctico, sal de sodio			0.174mL
10 mM EDTA			100μL
estreptomicina			5
penicilina			6.3
0,5% rojo fenol			0,1 ml
L-Glutamina			Artículo 14.6
Aminoácidos esenciales MEM			1 ml
MEM AA no esencial			0.5mL
Bsa			100