Transferencia de genes mediada por biolística: una técnica para administrar genes de interés en células diana a través de una pistola de genes biolísticos

Resumen

Fuente: Taylor, T., et al. Transformación biolística de un gen marcado con fluorescencia en el patógeno fúngico oportunista Cryptococcus neoformans. J. Vis. Exp. (2015).

En este video, demostramos el protocolo de entrega de genes biolísticos mediada por pistolas en células cultivadas. Este método proporciona un método simple de transformación genética estable utilizando una cantidad mínima de ADN.

Protocolo

1. Preparación del ADN

1. Prepare discos biolísticos de macroportadores naranjas sumergiéndolos en etanol al 100% con pinzas. Coloque los discos en una placa de Petri grande que contenga drierita para que se sequen (asegúrese de que la drierita no toque los discos).
2. Una vez secos, presione los discos macroportadores en los soportes de discos de plata (previamente limpiados con etanol al 100%).
3. Perlas microportadoras de oro Vortex suspendidas en etanol al 100% y alícuota 12 μl en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, un tubo por transformación.
4. Añadir a cada tubo en orden: 2 μg de ADN (preferiblemente 2 μl de 1 μg/μl de ADN), 10 μl de CaCl₂ 2,5 M y 2 μl de base libre de espermidina 1 M.
5. Configure un control negativo como en el paso 1.4 pero sin ADN.
6. Agite cada tubo en vórtice e incube a temperatura ambiente durante 5 min. Agite suavemente cada tubo de vez en cuando para volver a suspender las perlas asentadas durante esta incubación.
7. Gire los tubos a 225 x g durante 30 segundos para pellet las perlas de oro recubiertas de ADN. Retire con cuidado el sobrenadante (por pipeteo o aspiración) y deséchelo.
8. Vuelva a suspender las perlas completamente en 600 μl de etanol al 100% pipeteando lentamente hacia arriba y hacia abajo.
9. Gire los tubos a 225 x g durante 30 segundos para pellets las perlas sin empaquetarlas. Retire y deseche con cuidado el sobrenadante.
10. Vuelva a suspender las perlas de oro recubiertas de ADN en 8 μl de etanol al 100% pipeteando lentamente hacia arriba y hacia abajo.
11. Pipetear las perlas de oro recubiertas de ADN en el centro del disco biológico de 1 cm de diámetro y dejar secar.
    nota: Un círculo de oro seco visible en el centro del disco biolístico indica que hay una concentración suficiente de perlas de oro.
    nota: Los discos macroportadores cargados con perlas de oro recubiertas de ADN ya están listos para su uso con la pistola de genes.

>2. Operando la pistola genética

1. Encienda la bomba de vacío.
2. Encienda el gas helio girando la perilla en sentido contrario a las agujas del reloj hasta alcanzar una presión de aproximadamente 2,200 psi en el manómetro.
3. Encienda la pistola genética accionando el interruptor rojo a la izquierda.
4. Asegúrese de que los caudales de la aspiradora y la ventilación estén ajustados para que la aspiradora alcance las 28 pulgadas Hg en 15 segundos.
5. Asegúrese de que la distancia entre el disco de ruptura y el macroportador sea de aproximadamente 3/8 de pulgada.
6. Limpie toda la cámara con etanol.
7. Sumerja los discos de ruptura en etanol al 100%. Deje secar sobre una superficie estéril (por ejemplo, una placa de Petri).
8. Utilice una llave dinamométrica para aflojar el soporte del disco de ruptura. Inserte un disco de ruptura limpio en el soporte. Vuelva a atornillar el soporte del disco de ruptura en su lugar y apriételo con una llave dinamométrica girándolo una vez hacia la derecha.
   nota: Los discos de ruptura se reemplazarán después de cada toma.
9. Sumerja las pantallas de malla en etanol al 100%. Deje secar sobre una superficie estéril (por ejemplo, una placa de Petri).
10. Una vez seco, coloque una pantalla de malla lavada en la placa de montaje de plástico blanco. Coloque el soporte del disco macroportador con el lado del ADN hacia abajo en la cámara del disco. Enrosque la tapa plateada y coloque la placa de montaje en la ranura más alta.
    nota: La pantalla de malla se reemplazará después de cada toma.
11. Coloque una placa de agar YPD que contenga 1 M de sorbitol en la placa inferior.
12. Cierre la puerta de la cámara y fíjela en su lugar.
13. Empuje y mantenga presionado el interruptor rojo central hacia arriba para activar la aspiradora y permitir que la aspiradora alcance las 28 pulgadas Hg. Una vez que se alcance el nivel de vacío adecuado, mueva este interruptor a la posición hacia abajo. Cuando esté listo, mantenga presionado el interruptor rojo a la derecha para disparar. Cuando el disco de ruptura explote, suelte inmediatamente el botón de disparo y presione el interruptor rojo central a la posición central para ventilar la cámara a 0 psi.
14. Limpie los restos del disco de ruptura y apague la pistola genética. Luego apague el gas helio girando la perilla en el sentido de las agujas del reloj y, finalmente, apague la bomba de vacío.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Perlas de oro de 0,6 μm	Bio-Rad	Números 165-2262	http://www.bio-rad.com
Base sin espermatozoides	Sigma- Aldrich	S0266	https://www.sigmaaldrich.com
Discos de ruptura de 1350 psi	Bio-Rad	165-2330	http://www.bio-rad.com
Pantallas de detención	Bio-Rad	De 165 a 2336	http://www.bio-rad.com
Discos Macrocarriers	Bio-Rad	De 165 a 2335	http://www.bio-rad.com
Sistema PDS-1000/He	Bio-Rad	Números 165-2257	http://www.bio-rad.com
Centrífuga Microfuge 18	Beckman Coulter	F241.5P	www.beckmancoulter.com