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>1. Recubrimiento de platos de poli-ornitina/laminina (Po/L)
NOTA: Los volúmenes se adaptan para recubrir una placa de 24 pocillos.
- Si es necesario, coloque un cubreobjetos estéril de 12 mm en el pocillo.
- Cubrir los pocillos con 500 μL de 10 μg/mL de solución de Poly-L-Ornitina disuelta en agua.
- Deje que los pozos se asienten a temperatura ambiente durante 1 h.
- Retire la solución de Poly-L-Ornithine y seque al aire durante 30 min.
- Cubrir los pocillos durante la noche a 37 °C con 500 μL de laminina de 3 μg/mL en bicarbonato L-15.
nota: Los pocillos se pueden almacenar a 37 °C durante 7 días en la incubadora. Para incubaciones largas, agregar PBS estéril entre los pocillos puede ayudar a evitar la evaporación del medio.
>2. Cultivo de neuronas motoras
- Diluya los MN a la densidad adecuada, generalmente de 5.000 a 10.000 células en 500 μL de medio de cultivo por pocillo en una placa de 24 pocillos.
nota: La densidad de siembra es de alrededor de 30.000 y 1.500 celdas para placas de 6 y 96 pocillos, respectivamente.
- Retire la solución de laminina con un P1000.
- Transfiera inmediatamente los MN diluidos en el medio de cultivo a las placas de recubrimiento para evitar el secado.
- Incubar el cultivo durante 2 días a 37 °C.
>3. Magnetofección de las neuronas motoras
NOTA: En los siguientes pasos, las cantidades utilizadas están destinadas a la transfección de un pocillo de una placa de 24 pocillos. Consulte el protocolo del fabricante para otro formato.
- Para la preparación del ADN, resuspender 1 μg de ADN en 50 μL de medio de cultivo neuronal y vórtice durante 5 s. En este caso, se utilizan plásmidos de 9 kb con un promotor CAGGS (pCAGEN) que controla el ADNc de neurofilamentos.
- Para la preparación del tubo de perlas, resuspenda 1,5 μL de perlas en 50 μL de medio de cultivo neuronal.
- Añadir la solución de 50 μL de perlas a la solución de 50 μL de ADN e incubar durante 20 min a temperatura ambiente (volumen total = 100 μL).
- Durante esta incubación, extraiga 100 μL de medio de cultivo del pocillo que se va a transfectar.
NOTA: Coloque la placa magnética en la incubadora para calentarla a 37 °C.
- Transfiera 100 μL de la mezcla de ADN/perlas al pocillo e incube la placa durante 20-30 minutos en la placa magnética a 37 °C.