1. Preparar la construcción retroviral
- Subclonar las cadenas alfa y beta del receptor de células T (TCR), separadas por un enlazador 2A, en un vector retroviral basado en MSCV (ejemplo, pMIAII o pMIGII).
nota: El enlazador 2A permite la expresión estequiométrica y concordante de las cadenas TCR alfa y beta desde un único marco de lectura abierto. El vector incluye un casete de proteína fluorescente IRES (ametrina o GFP) que se utiliza para rastrear las células transducidas y la eficiencia de la transducción.
- Aísle el ADN plasmídico utilizando un kit de preparación de plasma obtenido comercialmente o un producto similar. Utilice una concentración de trabajo de 1-2 μg μl-1.
>2. Generación de Líneas Celulares Productoras de Retrovirales
- Utilice un proceso de dos pasos para producir las líneas celulares productoras de retrovirus.
- Genere retrovirus por transfección transitoria de células 293T con tres plásmidos (pVSVG, pEQ-Pam3(-E) y vector de interés) y tome el sobrenadante retroviral de las células 293T para transducir la línea celular productora de retrovirus ecotrópico GP+E86.
- Aísle el 40% superior de las células productoras de GP+E86 que expresan fluorescencia mediante FACS y propague las células productoras de GP+E86 transducidas como fuente del virus.
nota: La generación de productores de títulos altos es fundamental para la transducción eficiente de las células de la médula ósea.
>3. Transferencia de genes de células madre mediada por retrovirus (Día -5)
- Descongele y cultive 0.5 -1.0 x 106 de cada línea celular productora GP+E86 en DMEM 10% (vol/vol) FBS completo para permitir un crecimiento suficiente para dos placas confluentes de 150 mm para el Día 0 de este protocolo.
nota: La descongelación de 0,5 - 1,0 x 106 de cada línea celular productora GP+E86 en una placa de 10 cm permitirá una confluencia del 30 al 50% en el día 5. Esto también permite 5 días de cultivo para expandir las líneas celulares productoras GP+E86 a dos placas confluentes de 150 mm para el día 0.
- Cultivo de línea celular productora de retrovirales en medios de cultivo de tejidos completos que contienen 5% de suero fetal de ternero y ciprofloxacino (10 μg/ml) para evitar la contaminación por micoplasma.
nota: Suspender el uso de ciprofloxacina al generar el sobrenadante viral para la transducción de médula ósea. Evite el crecimiento excesivo de la línea celular productora, ya que esto afectará negativamente la eficiencia de la transducción de la médula ósea.
>4. Cultivo de células productoras de retrovirales (Día 0)
- Placa 3 x 106 células productoras de retrovirales por placa de 150 mm en 18 ml DMEM completo 20% (vol/vol) FBS.
- Incubar las células productoras de retrovirales a 37 °C durante la noche. Anticipe una placa de 150 mm para 15 millones de células de médula ósea (aproximadamente 2-3 ratones donantes).
>5. Sobrenadante retroviral (Día 1)
- Al día siguiente (aproximadamente 24 horas después), recoja el sobrenadante retroviral de las placas productoras (configuradas en el paso 4) extrayendo el sobrenadante retroviral directamente de la placa de 150 mm con una jeringa de 10 ml y filtre utilizando un filtro de jeringa de 0,45 μm.
- Sustituya cuidadosamente el sobrenadante retroviral extraído por 18 ml de DMEM completo fresco al 20% (vol/vol) de FBS.
- Suplementar el sobrenadante retroviral filtrado con IL-3 (20 g ml-1), IL-6 (50 g ml-1), MSCF (50 g ml-1) y bromuro de hexadimetrina (polibreno) (6 μg ml-1).
nota: El bromuro de hexadimetrina debe refrescarse cada 2 meses para evitar una disminución de la eficacia de la transducción retroviral.
>6. Supernadante retroviral y transducción (Día 2)
- Después de 24 horas, recoja el sobrenadante viral fresco de la línea celular productora de virus. Filtre el sobrenadante retroviral con una jeringa de 10 ml y un filtro de jeringa de 0,45 μm. Complemente el sobrenadante retroviral filtrado con IL-3 (20 g ml-1), IL-6 (50 g ml-1) y SCF (50 g ml-1), y bromuro de hexadimetrina (6 g ml-1).
- A continuación, retire cuidadosamente con una pipeta o aspire los 2 ml superiores de medio de cada pocillo de la placa de seis pocillos que contiene las células de médula ósea.
nota: Trabaje con cuidado para no aspirar la médula ósea, que generalmente se concentra en el medio del pozo. Alternativamente, el sobrenadante eliminado se puede centrifugar para recuperar las células de la médula ósea perdidas.
- A cada pocillo de la placa de 6 pocillos de la médula ósea, agregue 3 ml de sobrenadante viral fresco que contenga citocinas y bromuro de hexadimetrina. Envuelva las placas en plástico y repita la transducción de centrifugado a 1.000 x g durante 60 min a 37 °C. Desenvuelva las placas e incube las células a 37 °C y 5% deCO2 durante la noche (aproximadamente 24 horas).
>7. Adición de DMEM Fresco Suplementado (Día 3)
- Después de 24 horas, retire los 2 ml superiores de medio de cada pocillo de la placa de seis pocillos que contiene las células de la médula ósea, como en el paso 6.2. Reemplace los medios eliminados con DMEM 20% (vol/vol) FBS fresco suplementado con concentraciones finales de IL-3 (20 g ml-1), IL-6 (50 g ml-1) y SCF (50 g ml-1).
- Incubar las placas de médula ósea a 37 °C en la incubadora de CO2 durante otras 24 horas.
